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文檔簡介
1、目的:探討環(huán)氧合酶2(Cyclooxygenase 2,COX-2)對于香煙提取物(Cigarette Smoking Extract,CSE)所誘導的內(nèi)皮細胞凋亡的影響。 方法:體外培養(yǎng)人血管內(nèi)皮細胞株(ECV-304),取指數(shù)生長期細胞用于實驗。一支去過濾嘴燃燒的香煙由負壓吸引驅動裝置連續(xù)抽吸,吸入煙霧,經(jīng)三通管的一個出口入無血清1640培養(yǎng)液中制成懸液,過濾除菌,并稀釋成含不同濃度CSE的1640培養(yǎng)基,1 h內(nèi)用于實驗。
2、整個實驗分為三個部分:1.內(nèi)皮細胞培養(yǎng),按照CSE的干預濃度不同,將實驗分成四組,即對照組、0.5%CSE干預組、1%CSE干預組、5%CSE干預組。各組細胞培養(yǎng)12h后,采用Hoechst染色法和流式細胞術檢測細胞的凋亡情況,免疫細胞化學和Western Blot法檢測COX-2的蛋白表達。2.根據(jù)上一步實驗的結果,選取5%CSE為干預點,分別干預血管內(nèi)皮細胞0小時、3小時、6小時、9小時、12小時、24小時后,采用流式細胞術檢測細胞
3、的凋亡情況,Western Blot法檢測COX-2的蛋白表達。3.綜合前兩步實驗的結果,用5%CSE和不同濃度的選擇性COX-2抑制劑塞萊西布(celecoxib),共同干預內(nèi)皮細胞。根據(jù)塞萊西布的干預濃度不同,將實驗分為七組,即對照組(0%CSE)、5%CSE干預組、5%CSE+2.5μM/L塞萊西布干預組、5%CSE+5pM/L塞萊西布干預組、5%CSE+10μM/L塞萊西布干預組、5%CSE+20μM/L塞萊西布干預組、5%CS
4、E+50μM/L塞萊西布干預組。各組干預9小時后,采用流式細胞術檢測細胞凋亡情況,Western Blot法檢測COX-2的蛋白表達。 結果:(1)不同濃度的CSE分別干預內(nèi)皮細胞12小時后,Hoechst染色檢測細胞凋亡結果為,對照組(6.5±0.54%),干預組結果分別為(7.6±0.41%)、(13.5±1.78%)、(32.3±3.22%),0.5%CSE干預組與對照組比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05),余各組間均存在統(tǒng)計
5、學差異(P值均<0.05);流式細胞術測得細胞凋亡率為,對照組(1.61±0.24%),干預組結果分別為(2.01±0.36%)、(2.31±0.26%)、(5.40±0.39%),各組間比較,均存在統(tǒng)計學差異(P值均<0.05);Western Blot檢測COX-2表達結果顯示,隨著CSE干預濃度的升高,COX-2的表達逐漸增強,5%CSE干預后COX-2蛋白的表達最高。(2)5%CSE作用于內(nèi)皮細胞不同時間后,流式細胞術測得各組細
6、胞凋亡率為,對照組(1.73±0.16%)、各干預組分別為(2.69±0.28%)、(2.86±0.15%)、(3.66±0.40%)、(5.39±0.57%)、(8.87±0.41%)。3小時組和6小時組比較,結果無統(tǒng)計學差異(P>0.05),余各組間比較均存在統(tǒng)計學差異(P值均<0.05)。Western Blot檢測COX-2表達結果顯示,隨著5%CSE干預時間的延長,COX-2的表達逐漸增強。干預3小時的時侯COX-2蛋白的表達
7、開始增加,9小時達峰,12小時開始逐漸減弱,24小時時明顯消失。(3)5%CSE與不同濃度的選擇性COX-2抑制劑塞萊西布共同作用于內(nèi)皮細胞9小時后,流式細胞術檢測各組細胞凋亡率結果顯示對照組為(1.78±0.21%),各十預組分別為(3.90±0.27%)、(3.56±0.39%)、(3.13±0.38%)、(2.92±0.21%)、(4.69±0.50%)、(32.60±5.51%)。其中5%CSE+50μM/L塞萊西布干預組與其余
8、各組比較,內(nèi)皮細胞凋亡率顯著增高,結果存在統(tǒng)計學差異(P值均<0.05),余各組間比較均無統(tǒng)計學差異(P值均>0.05)。Western Blot檢測COX-2表達結果顯示,隨著塞萊西布干預濃度的升高,COX-2的表達逐漸減弱。 結論:(1)CSE可以誘導內(nèi)皮細胞的凋亡甚至死亡,且存在濃度依賴性和時間依賴性。(2)CSE能夠誘導內(nèi)皮細胞分泌COX-2蛋白,而且存在濃度依賴性和時間依賴性。(3)選擇性的COX-2抑制劑塞萊西布,可
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