持續(xù)異丙腎上腺素輸注對(duì)膿毒癥早期大鼠腦的保護(hù)作用.pdf

1、背景：
　　膿毒癥及其并發(fā)癥是重癥監(jiān)護(hù)室中發(fā)病和死亡最高的疾病。研究發(fā)現(xiàn)，所有的住院患者中，大約有2％的患者患有膿毒癥，而ICU患者膿毒癥患病率高達(dá)75％。在美國每年大約有750，000膿毒癥患者。
　　膿毒癥相關(guān)性腦病(SAE)是指缺乏中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染臨床或?qū)嶒?yàn)室證據(jù)，由全身炎性反應(yīng)引起的彌散性腦功能障礙。SAE患者常出現(xiàn)系列腦功能紊亂癥狀，可由輕微的譫妄發(fā)展到昏迷。SAE越嚴(yán)重，患者死亡率也越高。故早期發(fā)現(xiàn)及治療SAE對(duì)

2、減少膿毒癥相關(guān)性腦病患者的死亡率至關(guān)重要。目前關(guān)于SAE的發(fā)病機(jī)制仍不明了。SAE的病理生理可能涉及血腦屏障(blood brain barrier，BBB)功能障礙、微循環(huán)障礙、神經(jīng)炎癥反應(yīng)、氨基酸及神經(jīng)遞質(zhì)異常、線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激及凋亡。故目前治療SAE的關(guān)鍵在于早期發(fā)現(xiàn)患者出現(xiàn)的譫妄，查找潛在的病因，及時(shí)有效的治療感染及支持治療。
　　目前的一些研究提示許多“經(jīng)典”藥物，如作用于α和β受體的腎上腺素能藥除控制血壓、心率

3、、心肌收縮力量，調(diào)節(jié)氣道反應(yīng)外，研究還發(fā)現(xiàn)其參與調(diào)節(jié)一些代謝及中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能，在調(diào)控機(jī)體免疫反應(yīng)上亦有著重要的作用。目前關(guān)于調(diào)節(jié)β受體對(duì)膿毒癥的影響仍存在爭(zhēng)議[1，2]，其中原因與β亞型所產(chǎn)生的效應(yīng)不同[2]及與給藥劑量有關(guān)[3，4]。異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO)為非選擇性β受體激動(dòng)劑。研究發(fā)現(xiàn)，異丙腎上腺素具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫細(xì)胞功能及線粒體酶活性的作用。而大劑量的應(yīng)用可導(dǎo)致臟器功能異常。
　　目的：

4、　　本研究旨在觀察不同劑量的異丙腎上腺素持續(xù)輸注對(duì)膿毒癥早期大鼠血清炎癥因子及大腦病理變化、線粒體功能氧化應(yīng)激因子的影響，尋找對(duì)膿毒癥大鼠腦保護(hù)作用最佳的劑量，及探索其腦保護(hù)作用的機(jī)制，為臨床的應(yīng)用提供一定理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.分組及建立模型
　　SPF級(jí)SD雄性大鼠30只（中山大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），體重約250～300 g，實(shí)驗(yàn)前禁食12h，自由飲水。采用簡(jiǎn)單隨機(jī)方法，30只大鼠經(jīng)編號(hào)后使用隨機(jī)數(shù)字表

5、分為5組，每組6只，稱重;頸外靜脈置管24 h后內(nèi)毒素組腹腔注射LPS10 mg/kg同時(shí)持續(xù)輸注0.9％生理鹽水1 ml/h; ISO干預(yù)組即腹腔注射LPS10mg/kg后持續(xù)輸注ISO0.06、0.3和0.6μg/(kg.min);對(duì)照組腹腔注射同時(shí)持續(xù)輸注與其他組等體積的0.9％生理鹽水。觀察終點(diǎn)為持續(xù)輸注ISO或生理鹽水24 h。
　　2.各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)方法
　　2.1 大鼠一般狀況
　　觀察各組輸注ISO或生

6、理鹽水前30 min及注射后2h、6h和24 h的精神狀況，有無立毛，寒戰(zhàn)，腹瀉和出血傾向，并測(cè)量體溫、心率和呼吸頻率等基本生命體征。
　　2.2 大鼠炎癥反應(yīng)指標(biāo)
　　運(yùn)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA法）檢測(cè)注射LPS(或生理鹽水)后2h、6h及24 h的大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-10的濃度。
　　2.3 腦線粒體氧化應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)
　　采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定各組大鼠腦線粒體Mn-SOD活

7、性;采用硫代巴比妥酸(TBAC)法測(cè)定各組大鼠腦線粒體MDA活性;采用硝酸還原酶法測(cè)定各組大鼠腦線粒體NO含量;采用L-精氨酸氧化法測(cè)定各組大鼠腦線粒體iNOS含量。
　　2.4 腦組織病理損傷
　　制作石蠟切片于光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠腦組織的病理學(xué)改變。
　　3.統(tǒng)計(jì)方法
　　獲得的數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，結(jié)果采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示;多組間比較采用單因素方差分析，方差齊性者采用LSD法分析組間

8、差異，方差不齊者采用Dunnett T3法分析組間差異;P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.動(dòng)物一般狀況
　　對(duì)照組大鼠一般狀況良好，心率、呼吸頻率和體溫等基本生命體征平穩(wěn)。內(nèi)毒素組大鼠腹腔注射LPS一小時(shí)內(nèi)均出現(xiàn)反應(yīng)差，嗜睡，立毛，眼眶周圍滲血等膿毒癥狀態(tài)。ISO干預(yù)組一般狀況較LPS組輕。
　　2.大鼠血清炎癥因子水平變化
　　2.1 各組大鼠血清TNF-a水平變化
　　(1)持

9、續(xù)輸注ISO或生理鹽水2h后血清TNF-α水平
　　與對(duì)照組相比，內(nèi)毒素組和ISO處理組（低劑量、中劑量和高劑量組）TNF-α水平顯著升高（P均＜0.05）;與內(nèi)毒素組相比，中劑量和高劑量組TNF-α水平顯著降低（P均＜0.05）;與低劑量組相比，中劑量和高劑量組TNF-α水平顯著降低（P均＜0.05）。
　　(2)持續(xù)輸注ISO或生理鹽水6h后血清TNF-α水平
　　與對(duì)照組相比，內(nèi)毒素組和ISO處理組（低劑量、中劑

10、量和高劑量組）TNF-α水平顯著升高(P＜0.05);與內(nèi)毒素組相比，中劑量和高劑量組TNF-α水平顯著降低(P＜0.05);與低劑量組相比，高劑量組TNF-α水平顯著降低(P＜0.05)。
　　(3)持續(xù)輸注ISO或生理鹽水24 h后血清TNF-α水平
　　與對(duì)照組相比，內(nèi)毒素組、低劑量組和中劑量組TNF-α水平顯著升高(P＜0.05);與內(nèi)毒素組相比，中高劑量組TNF-α水平顯著降低（P＜0.05）;與低劑量和中劑量組相

11、比，高劑量組TNF-α水平顯著降低（P＜0.05）。
　　2.2 各組大鼠血清IL-1β水平的變化
　　(1)持續(xù)輸注ISO或生理鹽水2h后血清IL-1β水平
　　與對(duì)照組相比，內(nèi)毒素組和ISO處理組（低劑量、中劑量和高劑量組）IL-1β水平顯著升高（P均＜0.05）;與內(nèi)毒素組相比，低、中、高劑量組IL-1β水平均無差異（P＞0.05）。
　　(2)持續(xù)輸注ISO或生理鹽水6h后血清IL-1β水平
　　與

12、對(duì)照組相比，內(nèi)毒素組和ISO處理組（低劑量、中劑量和高劑量組）IL-1β水平顯著升高（P均＜0.05）;與內(nèi)毒素組相比，低、中、高劑量組IL-1β水平均無差異(P＞0.05)。
　　(3)持續(xù)輸注ISO或生理鹽水24 h后血清IL-1β水平
　　與對(duì)照組相比，內(nèi)毒素組和ISO處理組（低劑量、中劑量和高劑量組）IL-1β水平顯著升高（P均＜0.05）;與內(nèi)毒素組相比，低、中、高劑量組IL-1β水平均無差異(P＞0.05)。

13、r>　　2.3 各組大鼠血清IL-10水平的變化
　　(1)持續(xù)輸注ISO或生理鹽水2h后血清IL-10水平
　　與內(nèi)毒素組相比，低中高劑量組IL-10水平無差異(P＞0.05)
　　(2)持續(xù)輸注ISO或生理鹽水6h后血清IL-10水平
　　與內(nèi)毒素組相比，低劑量組IL-10水平顯著降低(P＜0.05)。
　　(3)持續(xù)輸注ISO或生理鹽水24 h后血清IL-10水平
　　與內(nèi)毒素組相比，中高劑量組

14、IL-10水平著降低(P＜0.05);
　　3.腦線粒體電鏡下改變
　　正常對(duì)照組細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)可見圓形或是橢圓形線粒體，線粒體邊界清楚，基質(zhì)均勻，線粒體內(nèi)外膜無斷裂，線粒體嵴清晰可見。與對(duì)照組相比，內(nèi)毒素組線粒體內(nèi)膜境斷裂，嵴減少，溶解，消失，基質(zhì)內(nèi)可見空泡化。相比于內(nèi)毒素組，異丙腎上腺素干預(yù)組神經(jīng)元核膜皺縮減輕，線粒體嵴減少減輕，基質(zhì)空泡樣化減少，尤以中劑量組改善最為顯著。
　　4.各組大鼠腦氧化應(yīng)激指標(biāo)
　　4

15、.1 iNOS活性變化:與對(duì)照組相比，內(nèi)毒素組與ISO干預(yù)組的iNOS活力顯著升高(P＜0.05)，與內(nèi)毒素組相比，中高劑量組的iNOS活性顯著升高(P＜0.05)。
　　4.2 NO含量變化:與對(duì)照組相比，內(nèi)毒素組NO含量顯著升高;與內(nèi)毒素組相比較，低中高劑量NO含量均顯著降低(P＜0.05)，尤以中劑量最為明顯。
　　4.3 SOD活性變化:與對(duì)照組相比，內(nèi)毒素組SOD活性顯著下降(P＜0.05);與內(nèi)毒素組相比，低中劑

16、量組SOD活性顯著升高(P＜0.05)。
　　4.4 MDA含量變化:與對(duì)照組相比，內(nèi)毒素組MDA含量顯著升高(P＜0.05);與內(nèi)毒素組相比，低、中劑量組MDA含量顯著下降(P＜0.05)。與中劑量相比，高計(jì)量組MDA含量顯著升高(P＜0.05)。
　　5.各組大鼠腦組織病理切片光鏡下表現(xiàn)
　　光鏡下可見正常組神經(jīng)元細(xì)胞大小正常，形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰;內(nèi)毒素組見大量神經(jīng)元細(xì)胞胞體縮小，核固縮，深染，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清，細(xì)胞周圍間隙