BAFF介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎B細(xì)胞活化及CP-25的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種慢性系統(tǒng)性自身免疫性疾病，其病理特征主要表現(xiàn)為滑膜炎癥和關(guān)節(jié)侵蝕。目前RA發(fā)病機(jī)制仍不清楚，研究表明B細(xì)胞在RA的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。B細(xì)胞活化因子(B cell activating factor of TNF family, BAFF)是維持體內(nèi)B細(xì)胞穩(wěn)態(tài)重要細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)B細(xì)胞存活、分化和活化。BAFF有三個(gè)受體：B細(xì)胞活化因子受體(B cell act

2、ivating factor of the TNF family receptor, BAFF-R)、B細(xì)胞成熟抗原(B cell maturation antigen, BCMA)和跨膜蛋白活化因子鈣離子信號(hào)調(diào)節(jié)親環(huán)素配體(transmembrane activator and calciummodulator and cyclophilin ligand interactor, TACI)。BAFF過表達(dá)與RA等自身免疫性疾病發(fā)病機(jī)

3、制和疾病進(jìn)程密切相關(guān)。BAFF通過結(jié)合其受體激活介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。那么在RA病程中，BAFF是否通過其受體介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路參與B細(xì)胞活化？目前少有報(bào)道。
　　CP-25是芍藥苷結(jié)構(gòu)修飾單體化合物。課題組前期研究表明CP-25對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎有明顯治療作用。CP-25還通過下調(diào)CD40、CD80、CD83、CD86和MHC-Ⅱ的表達(dá)來抑制由前列腺素E2或腫瘤壞死因子α刺激的樹突狀細(xì)胞的成熟。那么，CP

4、-25對(duì)實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎治療作用是否與其調(diào)節(jié)異常活化的B細(xì)胞功能有關(guān)？CP-25對(duì)異?；罨疊細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)是否與其調(diào)控BAFF/BAFF受體介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路有關(guān)？CP-25與目前臨床使用治療RA的生物制劑依那西普(Etanercept)或利妥昔單抗(Rituximab)對(duì) B細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)有怎樣的異同點(diǎn)？這些都是本課題要解決的重要問題。
　　本研究中，我們觀察了RA患者血清中BAFF水平、B細(xì)胞上BAFF受體及經(jīng)典和非經(jīng)典NF

5、-κB信號(hào)通路的活化情況，并分析了BAFF水平與臨床和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)之間的相關(guān)性。體外建立了BAFF刺激的活化B細(xì)胞模型，我們檢測(cè)了經(jīng)BAFF刺激的B細(xì)胞上BAFF受體及BAFF介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路的變化。同時(shí)我們觀察了CP-25對(duì)BAFF刺激的B細(xì)胞功能及BAFF介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路的影響。并比較了CP-25和目前臨床使用治療RA的生物制劑(Etanercept或Rituximab)對(duì)B細(xì)胞功能調(diào)節(jié)的作用特點(diǎn)。
　　目的：<

6、br>　?。?）闡明在RA病程中，BAFF介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路參與B細(xì)胞活化的機(jī)制。
　?。?）明確CP-25對(duì)BAFF與其受體介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控作用。
　　（3）比較CP-25和生物制劑(Etanercept或Rituximab)對(duì)異?；罨腂細(xì)胞功能調(diào)控的作用特點(diǎn)。
　　方法：
　　入選 RA患者，在入組時(shí)評(píng)價(jià)臨床和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。收集 RA患者和健康對(duì)照(healthy controls, HC

7、s)的血液樣品。人淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)，免疫磁珠陽性分選B細(xì)胞。線性回歸分析 BAFF水平與臨床變量或?qū)嶒?yàn)室參數(shù)之間的相關(guān)性；ELISA法檢測(cè)血清中BAFF水平；蛋白芯片技術(shù)檢測(cè)免疫球蛋白水平和細(xì)胞因子水平。體外，人淋巴細(xì)胞分離液分離正常健康人 PBMCs。用 BAFF(100ng/ml)和 CP-25(10-5mol/L)或Etaner

8、cept(10μg/ml)或Rituximab(5μg/ml)處理后，CCK-8檢測(cè)B細(xì)胞的增殖；流式細(xì)胞術(shù)分析B細(xì)胞亞群和BAFF受體(BAFFR、BCMA和TACI)的表達(dá)；Western blotting分析信號(hào)通路中蛋白 MKK3、MKK6、P-p38、P-p65、TRAF2和 p100/52的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1. BAFF與其受體介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路參與RA中B細(xì)胞活化
　　1.1. RA血清中免

9、疫球蛋白和細(xì)胞因子的水平高于正常人
　　與HCs組相比，RA患者血清中IgA、IgE、IgD、IgG1、IgG2、IgG4水平升高；IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-γ、MCP-1、IL-4和IL-13水平明顯升高。尤其是，IL-1α、IL-4和TNF-α的水平升高更明顯。IgM和IL-10水平無差異顯著性。
　　1.2. RA患者中B細(xì)胞亞群異?；罨?br>　　與 HCs組相比，RA患者中 C

10、D19+B細(xì)胞、 CD19+CD27+B細(xì)胞、CD19+CD20+CD27+B細(xì)胞和CD19+CD20-CD27+B細(xì)胞的百分比顯著增加。
　　1.3. RA患者中B細(xì)胞上BAFF三個(gè)受體表達(dá)高于正常人
　　與HCs相比，RA患者中CD19+BAFFR+B細(xì)胞、CD19+BCMA+B細(xì)胞和CD19+TACI+B細(xì)胞的百分比顯著增加。
　　1.4. BAFF水平與RA患者中的實(shí)驗(yàn)室和臨床指標(biāo)的相關(guān)性
　　RA患者中

11、的BAFF水平明顯高于HCs組。RA患者和HCs中BAFF的濃度分別為270±24 pg/ml和192±9 pg/ml。兩組之間有顯著性差異（p=0.008）。BAFF水平與RF（p=0.03）和CRP（p=0.003）的實(shí)驗(yàn)室參數(shù)之間存在顯著相關(guān)性。BAFF水平與DAS28、SJC或TJC之間也有相關(guān)性。但BAFF水平與抗CCP抗體無關(guān)。
　　1.5. RA患者B細(xì)胞中BAFF介導(dǎo)的信號(hào)通路中信號(hào)分子的表達(dá)情況
　　與HC

12、s組相比，RA患者中MKK3、MKK6、P-p38、P-p65、TRAF2和p52表達(dá)增高，RA中p100表達(dá)下降。
　　2．CP-25下調(diào)BAFF與其受體介導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路調(diào)控B細(xì)胞功能
　　2.1. CP-25抑制B細(xì)胞增殖
　　與Control組相比，BAFF促進(jìn)B細(xì)胞增殖。與BAFF組相比，CP-25、Rituximab和Etanercept均能抑制B細(xì)胞增殖，三個(gè)藥物之間沒有差異顯著性。
　　2.2

13、. CP-25下調(diào)活化B細(xì)胞亞群
　　與Control組相比，BAFF能增加CD19+B細(xì)胞、CD19+CD20+B細(xì)胞、CD19+CD27+B胞和CD19+CD20+CD27+B細(xì)胞的百分比和數(shù)目。與BAFF組相比，CP-25能下調(diào)CD19+B細(xì)胞、CD19+CD20+B細(xì)胞、CD19+CD27+B細(xì)胞和CD19+CD20+CD27+B細(xì)胞的百分比和數(shù)目，與Control組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與CP-25組相比，Rituximab

14、和Etanercept過度抑制CD19+B細(xì)胞、CD19+CD20+B細(xì)胞、CD19+CD27+B細(xì)胞和CD19+CD20+CD27+B細(xì)胞百分比和數(shù)目，明顯低于Control組和CP-25組，比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2.3. CP-25下調(diào)CD19+BAFFR+B細(xì)胞、CD19+BCMA+B細(xì)胞和CD19+TACI+B細(xì)胞百分含量
　　與Control組相比，BAFF顯著上調(diào)CD19+BAFFR+B細(xì)胞、CD19+BCMA

15、+B細(xì)胞和CD19+TACI+B細(xì)胞百分含量。與BAFF組相比，CP-25下調(diào)CD19+BAFFR+B細(xì)胞、CD19+BCMA+B細(xì)胞和CD19+TACI+B細(xì)胞百分含量，與Control組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Rituximab和Etanercept過度抑制CD19+BAFFR+B細(xì)胞和CD19+BCMA+B細(xì)胞百分含量，并使CD19+BAFFR+B細(xì)胞百分含量明顯低于Control組和CP-25組，比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2.4.

16、 CP-25對(duì)B細(xì)胞中MKK3、TRAF2、P-p38、P-p65和p100/52表達(dá)的影響
　　與Control組相比，BAFF能夠上調(diào)MKK3、TRAF2、P-p38、P-p65和p52的表達(dá)。與BAFF組相比，CP-25、Rituximab可顯著下調(diào)BAFF刺激的B細(xì)胞中升高的MKK3、P-p38、P-p65、TRAF2和p52的表達(dá)。Etanercept也可顯著降低BAFF誘導(dǎo)的MKK3、P-p38、P-p65和p52的表

17、達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1.高水平的BAFF通過其受體介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路參與RAB細(xì)胞的異常活化。
　　2. RA血清中升高的BAFF水平與RA的疾病活動(dòng)度相關(guān)。
　　3. BAFF可能作為診斷和治療RA的一種新的生物標(biāo)志物。
　　4. CP-25對(duì)B細(xì)胞功能的適度下調(diào)可能與其調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。
　　5. Etanercept和Rituximab過度抑制BAFF刺激的B細(xì)胞功能，其對(duì)B細(xì)