Notch信號(hào)通路在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病理機(jī)制中作用的初步研究.pdf

1、研究目的:
　　本課題研究目的在于分析Notch信號(hào)在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎T細(xì)胞及滑膜組織中的活化狀態(tài)，并探討干預(yù)Notch信號(hào)通路對(duì)膠原誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎發(fā)病的影響及其潛在的調(diào)節(jié)機(jī)制，從而明確Notch信號(hào)在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病理機(jī)制中的作用，為靶向Notch通路治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎提供理論依據(jù)。
　　研究方法:
　　(1)應(yīng)用牛Ⅱ型膠原免疫DBA/1J小鼠，構(gòu)建膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型（CIA模型），對(duì)發(fā)病小鼠進(jìn)行關(guān)節(jié)評(píng)分并取病變關(guān)節(jié)進(jìn)行

2、HE染色以反映關(guān)節(jié)炎癥的嚴(yán)重程度。
　　(2)采用Western blot檢測(cè)CIA小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞Notch信號(hào)胞內(nèi)段(NICD)的蛋白表達(dá)水平。通過(guò)免疫組化檢測(cè)CIA小鼠發(fā)病關(guān)節(jié)滑膜局部NICD的表達(dá)。
　　(3)采用γ-分泌酶抑制劑DAPT腹腔注射CIA小鼠阻斷Notch信號(hào)通路。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DAPT治療后CIA小鼠脾臟T細(xì)胞亞群的比例，流式芯片檢測(cè)血漿細(xì)胞因子的表達(dá)水平，并通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)小鼠關(guān)節(jié)局部

3、炎癥情況。
　　(4)通過(guò)在體外培養(yǎng)的CD4+T細(xì)胞中加入細(xì)胞因子(TGF-β，IL-1β，和IL-6)建立Th17細(xì)胞的體外擴(kuò)增體系，觀察加入DAPT以及Notch配體的融合蛋白D1/D3對(duì)Th17細(xì)胞體外擴(kuò)增的影響。
　　(5)采用RT-PCR法檢測(cè)正常小鼠脾臟與骨髓MDSC Notch信號(hào)分子的表達(dá)。
　　研究結(jié)果:
　　(1)與對(duì)照組小鼠相比，CIA小鼠脾CD4+T細(xì)胞NICD蛋白表達(dá)水平明顯增高，病變關(guān)

4、節(jié)滑膜組織中NICD蛋白表達(dá)亦顯著增多。
　　(2) DAPT體內(nèi)阻斷Notch信號(hào)可以延緩關(guān)節(jié)炎發(fā)病并明顯改善關(guān)節(jié)炎癥，DAPT處理后CIA小鼠脾臟Th1和Th17細(xì)胞比例及絕對(duì)數(shù)量均顯著減少(P＜0.05)，但對(duì)Th2細(xì)胞及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞無(wú)明顯影響（P＞0.05）。DAPT處理后CIA小鼠血漿IFN-γ和IL-17表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。而血漿IL-4，IL-10和IL-22水平均無(wú)明顯變化（P＞0.05）。
　　(

5、3)DAPT處理可抑制Th17細(xì)胞的體外擴(kuò)增，而D3處理可以上調(diào)Th17細(xì)胞的比例、絕對(duì)數(shù)和培養(yǎng)上清中的IL-17水平（P＜0.05）。但D1處理并沒(méi)有對(duì)Th17細(xì)胞增殖起到明顯促進(jìn)作用。
　　(4)正常小鼠骨髓與脾臟MDSC表達(dá)Notch四種受體分子，四種受體分子在兩種MDSC中表達(dá)水平未見(jiàn)明顯差異（P＞0.05）。骨髓MDSC Dll4表達(dá)水平明顯高于脾臟MDSC(P＜0.001)，而Jagged1、Jagged2和Dll1三

6、種配體分子在骨髓與脾臟MDSC中表達(dá)水平未見(jiàn)明顯差異(P＞0.05)，二者均不表達(dá)Dll3。與骨髓MDSC相比，脾臟MDSC Notch靶基因Hes1 mRNA表達(dá)明顯增高(P＜0.01)。
　　研究結(jié)論:
　　CIA小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞及滑膜局部組織中Notch信號(hào)通路呈活化狀態(tài)。γ-分泌酶抑制劑DAPT處理可以明顯改善CIA小鼠關(guān)節(jié)炎癥，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制Notch信號(hào)進(jìn)而抑制Th1/Th17細(xì)胞的產(chǎn)生及其相關(guān)炎癥因