恥垢分枝桿菌突變菌株庫的建立及耐卷曲霉素突變株的篩選與性質(zhì)研究.pdf

1、結(jié)核病(Tuberculosis，TB)是一種嚴(yán)重危害人類健康的傳染病，其病原菌是結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)。目前結(jié)核病處于復(fù)發(fā)期，全世界有將近三分之一，約20億人感染結(jié)核分枝桿菌，其中相當(dāng)一部分患者是持留菌引發(fā)的感染。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，每年死于結(jié)核病的人數(shù)，超出各類傳染病死亡人數(shù)的總和，僅2006年一年因結(jié)核病死亡的人數(shù)就有1.5億。同時(shí)多重耐藥結(jié)核病(multid

2、rug resistant tuberculosis，MDR-TB)的出現(xiàn)，以及人類免疫缺陷病毒(HIV)的聯(lián)合感染導(dǎo)致結(jié)核病再度在全球成流行趨勢，且感染率、發(fā)病率和死亡率均居高不下。中國作為一個(gè)有著巨大人口壓力的發(fā)展中國家，其結(jié)核病負(fù)擔(dān)也相當(dāng)嚴(yán)重。 目前臨床上使用的一線抗結(jié)核藥物如異煙肼(INH)、利福平(RFP)、鏈霉素(SM)、乙胺丁醇(EMB)和吡嗪酰胺(PZA)均已出現(xiàn)耐藥菌，這些藥物大部分是上個(gè)世紀(jì)60年代研發(fā)的，一

3、直未得到更新，這就制約了結(jié)核病控制進(jìn)程，尤其近期在非洲人陸發(fā)現(xiàn)極端耐藥結(jié)核分枝桿菌，該病原菌對所有一線抗結(jié)核約都耐受。耐藥結(jié)核分枝桿菌一旦傳播開來，人類將面臨重大災(zāi)難。因此，抗結(jié)核二線藥物就成為了結(jié)核病治療的生力軍。 卷曲霉素因其對耐多藥及持留期結(jié)核分枝桿菌具有獨(dú)特的療效，被臨床上確定為理想的二線結(jié)核病治療藥物，并且，該抗生素也是開發(fā)新的肽類結(jié)核病藥物的模板。隨著卷曲霉素住臨床上的應(yīng)用，耐藥菌株陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。因此，深入研究抗結(jié)核二

4、線約物的作用機(jī)制、耐藥機(jī)制，指導(dǎo)臨床合理用藥，以遏制或減緩結(jié)核分枝桿菌對此類藥物的耐約性，有效治療MDR-TB以及因持留期結(jié)核分枝桿菌引發(fā)的感染迫在眉睫。 轉(zhuǎn)座子突變技術(shù)是研究微生物功能基因組學(xué)的一項(xiàng)重要技術(shù)。為了進(jìn)一步探索結(jié)核分枝桿菌對卷曲霉素的耐藥機(jī)制，開發(fā)約物作川的新靶點(diǎn)，更好地指導(dǎo)臨床合理用藥，我們采用轉(zhuǎn)座突變技術(shù)，以非致病性、快生型恥垢分枝桿菌為模式生物，構(gòu)建突變菌株庫，并利用高濃度卷曲霉素(100 ug/ml)篩選高

5、耐藥的突變株，共4株，其耐約藥由10 ug/ml提高到200ug/ml。利用PCR技術(shù)，克隆4株突變耐藥株中已知的卷曲霉素耐藥基因(tlyA，rrs)，測序，將序列通過BLAST分析，發(fā)現(xiàn)4株突變株中，rrs基因均未發(fā)生突變，flyA則由于片段較短，難以分析。囚此，我們又嘗試了將突變菌株的基因組酶切自連，轉(zhuǎn)化劍人腸桿菌DH5a，利用卡那霉素篩選攜帶有轉(zhuǎn)座子中卡那霉素基因的自連質(zhì)粒，測序，獲知轉(zhuǎn)座子側(cè)翼序列。在篩選獲得卷曲霉素耐藥突變株后