抗恥垢分枝桿菌GlmU蛋白抗體的制備及glmU反義RNA表達(dá)的檢測(cè).pdf

1、分枝桿菌具有特殊的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，其核心部分由肽聚糖、聚阿拉伯糖半乳糖和分枝菌酸組成，其中分枝菌酸和聚阿拉伯糖半乳糖通過銜接雙糖(L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺)共價(jià)連接到肽聚糖大分子上。LIDP-N-乙酰葡糖胺是N-乙酰葡糖胺的糖基供體，而glmU基因編碼的GlmU蛋白具有葡糖胺-1-磷酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶活性和N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷轉(zhuǎn)移酶活性，參與UDP-N-乙酰葡糖胺的生物合成過程。本實(shí)驗(yàn)室張文利的研究結(jié)果表明，glmU基因?yàn)榉种U菌

2、生長(zhǎng)必需基因，因此，GlmU可作為研發(fā)抗結(jié)核新藥的作用靶標(biāo)。 為了深入研究GlmU酶活性對(duì)分枝桿菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和組成的影響并建立篩選GlmU酶抑制劑的細(xì)胞模型，本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建了glmU反義RNA表達(dá)載體pMind-glmU-AS，glmU反義RNA在恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)的表達(dá)受四環(huán)素的調(diào)控。為了優(yōu)化四環(huán)素濃度對(duì)glmU反義RNA表達(dá)的調(diào)節(jié)，需要用抗GlmU抗體檢測(cè)GlmU在恥垢分枝桿菌中的

3、表達(dá)量。 本論文的目的是：(1)用PCR法從恥垢分枝桿菌me<'2>155菌株基因組DNA中擴(kuò)增glmU基因，構(gòu)建pMD18-glmU克隆載體；(2)將glmU基因亞克隆到pET29b表達(dá)載體中，在宿主菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)GlmU重組蛋白。用親和層析法純化重組G1mU蛋白，并用Western Blotting方法鑒定GlmU重組蛋白：(3)用純化的GlmIJ蛋白免疫小鼠以制備抗GlmU的多克隆抗體：(4)用不同劑量的四

4、環(huán)素誘導(dǎo)glmU反義RNA在恥垢分枝桿菌中的表達(dá)，用抗GlmU抗體檢測(cè)GlmtJ在恥垢分枝桿菌中的表達(dá)量。 本論文所獲得結(jié)果如下： 1．glmU基因的擴(kuò)增和pMD18-glmU克隆載體的構(gòu)建用結(jié)核分枝桿菌GlmU的氨基酸序列從TIGR的恥垢分枝桿菌me<'2>155菌株基因組數(shù)據(jù)庫中獲得me<'2>155菌株的glmU基因的核苷酸序列(1449 bp)。根據(jù)該序列設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，并在上游與下游引物的5’端分別引入Nd

5、e I和XhoI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。用保真度高的LA Taq DNA聚合酶，以mc<'2>155菌株基因組DNA為模板擴(kuò)增了glmU基因，并將glmU基因連接到pMD18-T載體，構(gòu)建了pMD18-glmU克隆載體。對(duì)glmU基因進(jìn)行DNA測(cè)序測(cè)定，結(jié)果表明利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出正確的mc<'2>155 glmU基因。 2．表達(dá)載體pET29b-glmU的構(gòu)建用Nde I和Xho I雙酶切pMD18-glmU質(zhì)粒，回收和純化glmU基因，將

6、其連接到pET29b表達(dá)載體的Nde I和Xho I位點(diǎn)，構(gòu)建了pET29b-glmU表達(dá)質(zhì)粒。GlmU蛋白的C端與質(zhì)粒上的組氨酸標(biāo)簽形成融合蛋白。 3．GlmU蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)和純化將pET29b-glmU質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，用IPTG誘導(dǎo)攜帶pET29b-glmU質(zhì)粒的BL21(DE3)表達(dá)重組蛋白。用超聲方法破碎誘導(dǎo)后的BL21(DE3)，對(duì)上清和沉淀組分進(jìn)行SDS-PAGE和W

7、estern blotting分析，結(jié)果表明GlmU蛋白在BL21(DE3)中可溶性表達(dá)。 采用組氨酸-Ni<'2+>親和層析技術(shù)純化GlmU蛋白，對(duì)純化的GlmU蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)定量(考馬斯亮藍(lán)法)，第1 mlGlmU蛋白的濃度為0.635 mg/ml。SDS-PAGE和Western blotting分析結(jié)果表明GlmU蛋白的純度高。 4．抗GlmU蛋白的多克隆抗體的制備將純化的GlmU蛋白質(zhì)溶液經(jīng)過特殊處理后制備成免

8、疫用抗原，免疫BalB/C小鼠，制備抗血清，通過間接法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)得抗血清的抗體滴度為1：51200，采用抗血清及偶聯(lián)堿性磷酸酶的馬抗小鼠IgG二抗對(duì)恥垢分枝桿菌總蛋白中GlmU進(jìn)行Western Blotting分析，結(jié)果表明制備的GlmU多克隆抗體特異性高。 5．glmU反義RNA的誘導(dǎo)表達(dá)與GlmU蛋白的檢測(cè)分別用5 ng/ml、10 ng/ml和20 ng/ml的四環(huán)素誘導(dǎo)攜帶pMind-glmU-AS表達(dá)載體的m

9、c<'2> 155菌株表達(dá)反義RNA，繪制細(xì)菌生長(zhǎng)曲線，結(jié)果表明20 ng/ml濃度的四環(huán)素可抑制mc<'2> 155/pMind-glmU-AS的生長(zhǎng)，但Western Blotting分析結(jié)果顯示經(jīng)四環(huán)素誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)的mc<'2>155/pMind-glmU-AS中，GlmU蛋白表達(dá)量無明顯的變化。 結(jié)論：在本研究中，我們構(gòu)建了pET29b-glmU表達(dá)載體，在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)出大量的可溶性恥垢分枝桿菌Glm