抗恥垢分枝桿菌GlmU蛋白抗體的制備及glmU反義RNA表達的檢測.pdf

1、分枝桿菌具有特殊的細胞壁結構，其核心部分由肽聚糖、聚阿拉伯糖半乳糖和分枝菌酸組成，其中分枝菌酸和聚阿拉伯糖半乳糖通過銜接雙糖(L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺)共價連接到肽聚糖大分子上。LIDP-N-乙酰葡糖胺是N-乙酰葡糖胺的糖基供體，而glmU基因編碼的GlmU蛋白具有葡糖胺-1-磷酸乙?；D移酶活性和N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷轉移酶活性，參與UDP-N-乙酰葡糖胺的生物合成過程。本實驗室張文利的研究結果表明，glmU基因為分枝桿菌

2、生長必需基因，因此，GlmU可作為研發(fā)抗結核新藥的作用靶標。 為了深入研究GlmU酶活性對分枝桿菌細胞壁結構和組成的影響并建立篩選GlmU酶抑制劑的細胞模型，本實驗室已構建了glmU反義RNA表達載體pMind-glmU-AS，glmU反義RNA在恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)的表達受四環(huán)素的調控。為了優(yōu)化四環(huán)素濃度對glmU反義RNA表達的調節(jié)，需要用抗GlmU抗體檢測GlmU在恥垢分枝桿菌中的

3、表達量。 本論文的目的是：(1)用PCR法從恥垢分枝桿菌me<'2>155菌株基因組DNA中擴增glmU基因，構建pMD18-glmU克隆載體；(2)將glmU基因亞克隆到pET29b表達載體中，在宿主菌BL21(DE3)中誘導表達GlmU重組蛋白。用親和層析法純化重組G1mU蛋白，并用Western Blotting方法鑒定GlmU重組蛋白：(3)用純化的GlmIJ蛋白免疫小鼠以制備抗GlmU的多克隆抗體：(4)用不同劑量的四

4、環(huán)素誘導glmU反義RNA在恥垢分枝桿菌中的表達，用抗GlmU抗體檢測GlmtJ在恥垢分枝桿菌中的表達量。 本論文所獲得結果如下： 1．glmU基因的擴增和pMD18-glmU克隆載體的構建用結核分枝桿菌GlmU的氨基酸序列從TIGR的恥垢分枝桿菌me<'2>155菌株基因組數據庫中獲得me<'2>155菌株的glmU基因的核苷酸序列(1449 bp)。根據該序列設計一對PCR引物，并在上游與下游引物的5’端分別引入Nd

5、e I和XhoI限制性內切酶位點。用保真度高的LA Taq DNA聚合酶，以mc<'2>155菌株基因組DNA為模板擴增了glmU基因，并將glmU基因連接到pMD18-T載體，構建了pMD18-glmU克隆載體。對glmU基因進行DNA測序測定，結果表明利用PCR技術擴增出正確的mc<'2>155 glmU基因。 2．表達載體pET29b-glmU的構建用Nde I和Xho I雙酶切pMD18-glmU質粒，回收和純化glmU基因，將

6、其連接到pET29b表達載體的Nde I和Xho I位點，構建了pET29b-glmU表達質粒。GlmU蛋白的C端與質粒上的組氨酸標簽形成融合蛋白。 3．GlmU蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中表達和純化將pET29b-glmU質粒轉化到BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，用IPTG誘導攜帶pET29b-glmU質粒的BL21(DE3)表達重組蛋白。用超聲方法破碎誘導后的BL21(DE3)，對上清和沉淀組分進行SDS-PAGE和W

7、estern blotting分析，結果表明GlmU蛋白在BL21(DE3)中可溶性表達。 采用組氨酸-Ni<'2+>親和層析技術純化GlmU蛋白，對純化的GlmU蛋白進行蛋白質定量(考馬斯亮藍法)，第1 mlGlmU蛋白的濃度為0.635 mg/ml。SDS-PAGE和Western blotting分析結果表明GlmU蛋白的純度高。 4．抗GlmU蛋白的多克隆抗體的制備將純化的GlmU蛋白質溶液經過特殊處理后制備成免

8、疫用抗原，免疫BalB/C小鼠，制備抗血清，通過間接法酶聯(lián)免疫吸附試驗測得抗血清的抗體滴度為1：51200，采用抗血清及偶聯(lián)堿性磷酸酶的馬抗小鼠IgG二抗對恥垢分枝桿菌總蛋白中GlmU進行Western Blotting分析，結果表明制備的GlmU多克隆抗體特異性高。 5．glmU反義RNA的誘導表達與GlmU蛋白的檢測分別用5 ng/ml、10 ng/ml和20 ng/ml的四環(huán)素誘導攜帶pMind-glmU-AS表達載體的m

9、c<'2> 155菌株表達反義RNA，繪制細菌生長曲線，結果表明20 ng/ml濃度的四環(huán)素可抑制mc<'2> 155/pMind-glmU-AS的生長，但Western Blotting分析結果顯示經四環(huán)素誘導和未誘導的mc<'2>155/pMind-glmU-AS中，GlmU蛋白表達量無明顯的變化。 結論：在本研究中，我們構建了pET29b-glmU表達載體，在大腸桿菌BL21(DE3)中表達出大量的可溶性恥垢分枝桿菌Glm