血管內(nèi)皮Jagged1在調(diào)節(jié)老齡相關(guān)平滑肌增生中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的
　　 動脈粥樣硬化導(dǎo)致的心血管疾病嚴(yán)重影響人類的身心健康和生活質(zhì)量。雖然近年來血管介入技術(shù)極大提高了缺血組織血流灌注并改善患者預(yù)后，但局部血管壁對損傷刺激的過度修復(fù)反應(yīng)一直是困擾介入治療的難題。老齡加重?fù)p傷血管過度修復(fù)，在當(dāng)今人類社會逐步進(jìn)入老齡化的時代，重視和加強(qiáng)老齡促動脈粥樣硬化和損傷血管不良修復(fù)的研究具有重要意義。
　　 隨年齡增長體細(xì)胞逐漸出現(xiàn)衰老和功能異常。長期以來關(guān)于老齡促進(jìn)動脈粥樣硬化和血管損傷

2、后不良修復(fù)的研究主要集中在血管壁細(xì)胞衰老方面，但仍有一些現(xiàn)象并不能單純用細(xì)胞衰老理論解釋，如平滑肌細(xì)胞異常增殖是動脈粥樣硬化和損傷血管不良修復(fù)的主要病理改變，通常認(rèn)為衰老導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞增殖能力更強(qiáng)，但也有資料表明老齡個體平滑肌增殖能力下降；另外關(guān)于細(xì)胞衰老指標(biāo)檢測，有研究表明由老齡個體分離的平滑肌細(xì)胞β-半乳糖苷酶染色陽性，也有研究發(fā)現(xiàn)其為陰性。這些矛盾現(xiàn)象提示老齡促進(jìn)動脈粥樣硬化發(fā)生和血管損傷后過度增殖可能并不完全由細(xì)胞衰老引起。

3、r>　　 通常認(rèn)為老齡個體對炎癥因子和生長因子的反應(yīng)更強(qiáng)，是其促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖的機(jī)制。但事實上單純針對這些炎癥因子和生長因子的治療措施并不能完全有效抑制損傷血管過度增殖。器官、組織由多種細(xì)胞共同構(gòu)成，其發(fā)揮作用不完全是各種細(xì)胞獨(dú)立作用的結(jié)果，細(xì)胞間調(diào)節(jié)也起了重要作用。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮可通過細(xì)胞間調(diào)節(jié)影響平滑肌細(xì)胞生物學(xué)特性，然而相關(guān)研究多局限于一般成體情況下，尚不清楚老齡相關(guān)平滑肌細(xì)胞異常增殖是否也與內(nèi)皮的異常調(diào)節(jié)有關(guān)。
　　

4、 文獻(xiàn)報道，年齡相關(guān)的組織修復(fù)能力異?？赡芘cNotch信號途徑有關(guān)。分布于血管系統(tǒng)的Notch信號分子包括：受體(Notch1,3,4)、配體(Delta-4,Jagged1,2)和效應(yīng)器(HERP1,2,3)，與血管形成、發(fā)育和重構(gòu)密切相關(guān)。Notch信號是一種進(jìn)化保守、存在于多種組織的控制細(xì)胞增殖、分化、粘附等細(xì)胞命運(yùn)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，其對血管壁細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)主要是通過Jagged1/Notch1途徑實現(xiàn)的。Liu等發(fā)現(xiàn)Notch1

5、信號對增殖相關(guān)MAPK和PI3K/Akt信號系統(tǒng)的負(fù)調(diào)節(jié)有關(guān)，并且建立在更廣細(xì)胞模型上的研究表明Notch信號對NFkappaB、Wnt/TCF等增殖相關(guān)信號也有對話調(diào)節(jié)作用。但目前關(guān)于Notch信號調(diào)節(jié)血管壁細(xì)胞增殖的研究主要是單純針對內(nèi)皮或平滑肌細(xì)胞的研究，對其在血管壁細(xì)胞間相互調(diào)節(jié)中的作用尚不清楚。與其它信號系統(tǒng)不同，Notch信號可以通過側(cè)抑制機(jī)制調(diào)節(jié)鄰近細(xì)胞增殖。因此，老齡相關(guān)平滑肌細(xì)胞異常增殖可能與內(nèi)皮Notch信號對平滑肌

6、增殖相關(guān)信號的對話調(diào)節(jié)有關(guān)。另外，凋亡也是機(jī)體調(diào)節(jié)細(xì)胞生長的一種重要方式，Notch1信號不僅參與細(xì)胞增殖的調(diào)控，還影響細(xì)胞凋亡。Robert等將紅細(xì)胞與Jagged1過表達(dá)細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)Jagged1過表達(dá)細(xì)胞能誘導(dǎo)紅細(xì)胞凋亡，提示Jagged1/Notch1可通過細(xì)胞間調(diào)節(jié)影響細(xì)胞凋亡。細(xì)胞的生長狀態(tài)是增殖和凋亡系統(tǒng)平衡調(diào)節(jié)的結(jié)果，我們推測老齡個體平滑肌異常增殖可能是內(nèi)皮Jagged1/Notch1信號激活障礙導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞增殖-

7、凋亡系統(tǒng)調(diào)節(jié)失衡所致。
　　 綜上所述，我們擬從細(xì)胞和大體兩個層面探討內(nèi)皮細(xì)胞Jagged1是否通過對平滑肌增殖凋亡相關(guān)信號的調(diào)節(jié)參與老齡相關(guān)平滑肌細(xì)胞異常增殖。希望從一個新的角度揭示老齡促動脈粥樣硬化和血管損傷后不良修復(fù)的發(fā)病機(jī)制，為進(jìn)一步探索改善或治療老齡促動脈粥樣硬化和損傷血管不良修復(fù)的方法提供研究基礎(chǔ)。
　　 方法
　　 1．干擾和過表達(dá)載體構(gòu)建部分
　　 構(gòu)建含rat Jagged1siRNA的

8、腺病毒載體。使用Ambion 公司軟件設(shè)計后合成3個針對rat Jagged1基因的shRNA 序列，用pGensil-1.1重組構(gòu)建3個攜帶不同shRNA的表達(dá)質(zhì)粒，SacI 酶切鑒定及測序檢測連接是否正確及有無突變。轉(zhuǎn)染細(xì)胞后RealtimePCR 檢測篩選抑制效率最高的序列，將該序列其連接到穿梭質(zhì)粒PGSadeno，通過LR體外同源重組包裝重組腺病毒，XbaI 單酶切鑒定重組克隆是否正確。轉(zhuǎn)染293細(xì)胞擴(kuò)增，空斑實驗測定病毒滴度。

9、構(gòu)建含rat Jagged1基因的重組表達(dá)質(zhì)粒。XbaⅠ酶切含有全長大鼠Jagged1基因的質(zhì)粒pBOS-SN3T，膠回收后定向連接至線性化的真核表達(dá)載體質(zhì)粒pCMV-IRES-GFP中，得重組質(zhì)粒命名為p-rJagged1，轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增細(xì)菌，NheⅠ酶切酶切鑒定，回收凝膠，再進(jìn)一步轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增細(xì)菌。
　　 2.在體實驗部分
　　 復(fù)制大鼠頸動脈球囊損傷模型。2％戊巴比妥鈉麻醉，暴露左頸總動脈及頸內(nèi)、外動脈，自頸外動脈向近心

10、端插入1.5F 球囊導(dǎo)管至頸總動脈起始部，2個大氣壓使球囊膨脹30秒，后慢速回拉球囊至頸內(nèi)外動脈分叉處，反復(fù)3次。退出導(dǎo)管，注入病毒液后夾閉動脈約10min。結(jié)扎頸外動脈，逐層縫合后常規(guī)飼養(yǎng)。術(shù)后7、14和21天取頸動脈，中間切片HE 染色計算內(nèi)膜與中面積比值。免疫熒光觀察和western blot 檢測血管組織中GFP蛋白判斷轉(zhuǎn)染是否成功。Western blot 檢測PCNA蛋白表達(dá)。Realtime PCR檢測Jagged1mRN

11、A表達(dá)。組織Tunel 染色檢測凋亡率。
　　 3.體外實驗部分
　　 消化法培養(yǎng)大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(RAECs)，抗vWF免疫熒光染色鑒定。組織貼塊法培養(yǎng)大鼠主動脈平滑肌細(xì)胞(VSMCs)，抗α-SM-actin免疫熒光染色鑒定。利用Transwell insert 建立RAECs和VSMCs 共培養(yǎng)體系。免疫熒光觀察和流式檢測GFP 陽性細(xì)胞判斷轉(zhuǎn)染效率。細(xì)胞計數(shù)法、MTT 法和3H-TdR 摻入法檢測VSMCs 增

12、殖能力。Hoechst33342 染色和Annexin V-APC/7-AAD 雙標(biāo)流式檢測VSMCs 凋亡率。Westernblot 檢測Jagged1、NICD、Hey1、Bcl-2、α-SM-actin蛋白表達(dá)。Realtime PCR 檢測Jagged1、Notch1、Hey1mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)果
　　 1.大鼠Jagged1基因干擾腺病毒構(gòu)建及鑒定
　　 設(shè)計合成了3 條針對Jagged1基因的s

13、hRNA 質(zhì)粒,與pGenesil-1.1線性化載體連接，SacI 酶切鑒定得約900bp的DNA 條帶，提示穿梭質(zhì)粒構(gòu)建成功，測序鑒定證明目的序列插入正確，且沒有突變。將攜帶不同shRNA的穿梭質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞(Ecs)，Realtime PCR 篩選出抑制效率最高的序列為GGAGAGTTACAGAATGGGA。重組構(gòu)建攜帶用該序列的腺病毒，命名為Ad-si/rJagged1，XbaI 單酶切鑒定得約3K的小條帶，且大條帶大于提示

14、目的克隆是正確。將Ad-si/rJagged1轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，反復(fù)擴(kuò)增后，收集粗制病毒裂解液，經(jīng)空斑實驗測定，病毒滴度約為6×109 pfu/ml。
　　 2．Jagged1在調(diào)節(jié)老齡相關(guān)血管損傷后新生內(nèi)膜增生中的作用
　　 Western blot檢測轉(zhuǎn)染血管壁中有GFP蛋白表達(dá)，轉(zhuǎn)染后第2d、7d均有較強(qiáng)表達(dá)，并延續(xù)表達(dá)到損傷后21d，對側(cè)未轉(zhuǎn)染血管中沒有檢測到GFP蛋白表達(dá)。分別用老齡大鼠和幼齡大鼠復(fù)制頸動脈球囊損

15、模型。老齡組新生內(nèi)膜-中膜面積比(I/M)較幼齡組顯著增高。兩組頸動脈Jagged1mRNA水平在球囊損傷后均有一定程度增高，但老齡組Jagged1mRNA峰值較幼齡組出現(xiàn)時間晚，且水平低。同時，老齡組PCNA蛋白和新生內(nèi)膜細(xì)胞凋亡指數(shù)峰值較幼齡組出現(xiàn)時間晚，但PCNA蛋白峰值明顯增高，凋亡指數(shù)峰值明顯降低。分別用干擾腺病毒Ad-si/rJagged1或陰性對照腺病毒Ad-NSC轉(zhuǎn)染球囊損傷的幼齡大鼠頸動脈。Ad-si/rJagged1

16、轉(zhuǎn)染組的Jagged1表達(dá)較未轉(zhuǎn)染對照組峰值出現(xiàn)時間晚，水平降低，而Ad-NSC轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染對照組無統(tǒng)計學(xué)差異。同時，Ad-si/rJagged1轉(zhuǎn)染的幼齡大鼠，頸動脈損傷后，PCNA蛋白峰值水平明顯增高；新生內(nèi)膜內(nèi)細(xì)胞凋亡指數(shù)峰值則出現(xiàn)時間晚，且水平明顯降低；而這兩個指標(biāo)在Ad-NSC轉(zhuǎn)染組和control組間無統(tǒng)計學(xué)差異。最后，HE染色檢測損傷21d后新生內(nèi)膜情況， Ad-si/rJagged1轉(zhuǎn)染組I/M較未轉(zhuǎn)染組明顯增加(2.

17、45±0.18vs. 1.46±0.08, P<0.01)，而Ad-NSC轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組新生內(nèi)膜面積沒有顯著差別。
　　 3.Ecs Jagged1在調(diào)節(jié)老齡相關(guān)平滑肌增殖凋亡中的作用及機(jī)制研究
　　 3.1老齡降低Ecs Jagged1表達(dá)
　　 按大鼠年齡不同將Ecs分幼齡組和老齡組。老齡組Jagged1mRNA和蛋白水平均低于幼齡組。進(jìn)一步檢測Jagged1受體notch1及其下游靶基因Hey1表達(dá)，結(jié)果

18、顯示老齡組Notch1、Hey1mRNA水平均低于幼齡組，同時活化的notch1受體胞內(nèi)段NICD蛋白和靶基因Hey1蛋白也低于幼齡組。結(jié)果提示，老齡可以降低Ecs Jagged1表達(dá)，至少部分抑制Jagged1/Notch1信號通路的激活。
　　 3.2 老齡Ecs 促進(jìn)VSMCs 增殖、保護(hù)VSMCs 凋亡
　　 將不同年齡大鼠來源的Ecs與VSMCs 共培養(yǎng)，分為老齡Ecs 共培養(yǎng)組和幼齡Ecs共培養(yǎng)組。常規(guī)共培養(yǎng)

19、情況下，兩組VSMCs 增殖能力無統(tǒng)計學(xué)差異；但在共培養(yǎng)體系中加入10μg/mL的血小板源生長因子(Platelet-derived growth factor, PDGF)后，老齡Ecs 共培養(yǎng)組VSMCs 增殖能力均明顯高于幼齡Ecs 共培養(yǎng)組(26772±936cpm/wellvs.16424±1008cpm/well， P＜0.01)。常規(guī)共培養(yǎng)情況下，兩組VSMCs 凋亡率無統(tǒng)計學(xué)差異；但使用50μmol/L H2O2誘導(dǎo)24

20、h后，老齡Ecs 共培養(yǎng)組VSMCs 凋亡率明顯低于幼齡Ecs 共培養(yǎng)組(8.42±1.02％vs. 17.61±2.16％, P＜0.01)。結(jié)果表明，老齡Ecs 可以促進(jìn)VSMCs的增殖，保護(hù)H2O2誘導(dǎo)的VSMCs 凋亡。
　　 3.3 Ecs Jagged1抑制VSMCs 增殖、促進(jìn)VSMCs 凋亡
　　 Westernbolt 檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染干擾腺病毒Ad-si/rJagged1，可使幼齡大鼠Ecs Jagge

21、d1蛋白表達(dá)降低72％。轉(zhuǎn)染過表達(dá)質(zhì)粒p-rJagged1可使老齡大鼠Ecs Jagged1蛋白表達(dá)增加約5倍。用轉(zhuǎn)染Ad-si/rJagged1、Ad-NSC和未轉(zhuǎn)染腺病毒的幼齡大鼠Ecs分別與VSMCs共培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染Ad-si/rJagged1組VSMCs 增殖能力較未轉(zhuǎn)染組明顯增強(qiáng)，而轉(zhuǎn)染Ad-NSC組和未轉(zhuǎn)染組增殖能力無統(tǒng)計學(xué)差異。同時，轉(zhuǎn)染Ad-si/rJagged1組VSMCs 凋亡率較未轉(zhuǎn)染組明顯降低，而轉(zhuǎn)染Ad-NSC組和

22、未轉(zhuǎn)染組凋亡率無統(tǒng)計學(xué)差異。表明，下調(diào)Ecs Jagged1表達(dá)可以促進(jìn)VSMCs 增殖，保護(hù)VSMCs 凋亡。用轉(zhuǎn)染p-rJagged1， vector及未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的老齡大鼠Ecs分別與VSMCs 共培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染p-rJagged1組VSMCs 增殖能力較未轉(zhuǎn)染組明顯降低，而轉(zhuǎn)染vector組和未轉(zhuǎn)染組增殖能力無統(tǒng)計學(xué)差異。同時，轉(zhuǎn)染p-rJagged1組VSMCs 凋亡率較未轉(zhuǎn)染組明顯增高，而轉(zhuǎn)染vector組和未轉(zhuǎn)染組凋亡率無統(tǒng)計學(xué)

23、差異。表明，上調(diào)Ecs Jagged1表達(dá)可以抑制VSMCs 增殖，促進(jìn)VSMCs 凋亡。
　　 3.4 Ecs Jagged1對共培養(yǎng)VSMCs a-SM-actin蛋白表達(dá)的影響
　　 用不同年齡大鼠Ecs和VSMCs共培養(yǎng)(加入PDGF, 10μg/mL)48h后，檢測發(fā)現(xiàn)，老齡Ecs共培養(yǎng)組a-SM-actin蛋白低于幼齡Ecs共培養(yǎng)組。分別用轉(zhuǎn)染p-rJagged1、轉(zhuǎn)染vector和未轉(zhuǎn)染的老齡Ecs與VSM

24、Cs共培養(yǎng)(加入PDGF, 10μg/mL)48h后，p-rJagged1組a-SM-actin蛋白明顯高于vector和未轉(zhuǎn)染組(0.87±0.05vs0.57±0.03vs. 0.56±0.04，P＜0.01)。然后，分別用轉(zhuǎn)染了Ad-si/rJagged1、Ad-NSC和未轉(zhuǎn)染的幼齡Ecs與VSMCs共培養(yǎng)(加入PDGF, 10μg/mL)48h后，Ad-si/rJagged1組a-SM-actin蛋白明顯低于Ad-NSC和未轉(zhuǎn)染

25、組(0.24±0.02vs0.61±0.03vs. 0.62±0.03，P＜0.01)。提示上調(diào)Ecs Jagged1表達(dá)可以增加共培養(yǎng)SMCs的a-SM-actin表達(dá)，反之則降低其a-SM-actin蛋白水平。
　　 3.5 Bcl-2蛋白在Ecs Jagged1調(diào)節(jié)VSMCs 凋亡中作用
　　 不同年齡Ecs和VSMCs共培養(yǎng)24h后，加入50μmol/L的H2O2誘導(dǎo)24h。檢測VSMCs中抗凋亡蛋白Bcl-2水

26、平，發(fā)現(xiàn)老齡Ecs共培養(yǎng)組Bcl-2蛋白水平高于幼齡Ecs共培養(yǎng)組。分別用轉(zhuǎn)染p-rJagged1、轉(zhuǎn)染vector和未轉(zhuǎn)染的老齡Ecs替代原體系中的Ecs，再檢測發(fā)現(xiàn)p-rJagged1組VSMCs的Bcl-2水平顯著降低，提示Ecs Jagged1可以降低VSMCs抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)。轉(zhuǎn)染表達(dá)質(zhì)粒p-rBcl-2可明顯增高VSMCs Bcl-2蛋白水平，且與過表達(dá)Jagged1的Ecs共培養(yǎng)時，轉(zhuǎn)染p-rBcl-2的VSMCs

27、凋亡率較轉(zhuǎn)染vector或未轉(zhuǎn)染者明顯降低，提示Ecs Jagged1可能至少部分通過降低VSMCs的Bcl-2蛋白發(fā)揮促凋亡作用。
　　 結(jié)論
　　 1.血管損傷后Jagged1表達(dá)增高。但與幼齡大鼠相比，老齡大鼠Jagged1上調(diào)時間晚，達(dá)峰時間晚且峰值水平明顯降低。同時，損傷血管PCNA蛋白上調(diào)時間早，峰值水平明顯增高；而新生內(nèi)膜細(xì)胞凋亡指數(shù)峰值出現(xiàn)時間晚，且水平明顯低。
　　 2.下調(diào)血管Jagged1可

28、以加重新生內(nèi)膜增生。
　　 3.老齡降低培養(yǎng)Ecs Jagged1表達(dá)，至少部分抑制Jagged1/Notch1信號通路的激活。
　　 4.與老齡Ecs 共培養(yǎng)，VSMCs 增殖能力增強(qiáng)、VSMCs 凋亡減少。
　　 5. Ecs Jagged1具有抑制VSMCs 增殖、促進(jìn)VSMCs 凋亡的作用。6. Ecs Jagged1可增加共培養(yǎng)VSMCs a-SM-actin蛋白表達(dá)；可能至少部分通過降低VSMCs的B