STIM1-SOC細胞內(nèi)調(diào)節(jié)機制在血管平滑肌細胞增殖中的作用研究.pdf

1、研究背景： 動脈粥樣硬化性疾病的發(fā)病率呈明顯的增長趨勢，給人類的健康帶來嚴重的威脅。動脈粥樣硬化進程的特點是單核細胞和淋巴細胞被招募到血管內(nèi)膜，隨后誘導血管中層血管平滑肌細胞向內(nèi)膜遷移并增殖，引起血管腔狹窄導致病變發(fā)展。近年來，冠脈介入治療臨床應用給冠心病患者帶來了福音，但術后再狹窄也嚴重影響著冠脈介入治療的遠期效果，研究證實VSMCs過度增殖是導致冠脈介入術后再狹窄的主要原因。由此看出：VSMCs過度增殖在動脈粥樣硬化和冠脈介

2、入術后再狹窄中都有著重要的作用，然而起增殖的內(nèi)在機制目前尚未完全闡明。 基礎研究表明Ca2+是調(diào)節(jié)細胞增殖的重要物質(zhì)基礎，去除細胞外鈣后細胞增殖被明顯抑制。VSMCs胞內(nèi)Ca2+的調(diào)節(jié)依賴于Ca2+跨膜轉(zhuǎn)運與細胞內(nèi)鈣庫釋放和再攝取Ca2+等過程。在VSMCs胞膜上有兩種鈣內(nèi)流：1、由電壓門控鈣通道介導的鈣內(nèi)流，電壓門控鈣通道介導的鈣內(nèi)流可以引起VSMCs中Ca2+濃度的迅速增加，從而引起VSMCs的收縮；2、由鈣庫操縱型鈣通道介

3、導的鈣庫Ca2+釋放激活的Ca2+內(nèi)流。研究表明在VSMCs在疾病狀態(tài)下發(fā)生表型轉(zhuǎn)換后，電壓門控鈣通道相關蛋白的表達逐漸下調(diào)。那么在這種狀態(tài)下，是什么Ca2+通道介導細胞的Ca2+內(nèi)流?近年來研究證明由SOC引發(fā)的胞漿內(nèi)Ca2+濃度持續(xù)緩慢上升是細胞增殖的關鍵因素，在VSMCs上也發(fā)現(xiàn)了SOC通道的存在。 SOC激活機制是：外來刺激通過IP3和蘭尼定受體途徑引發(fā)細胞內(nèi)鈣庫中Ca2+的釋放，當胞內(nèi)鈣庫中Ca2+的濃度下降到一定程

4、度時，細胞膜上SOC開放產(chǎn)生CRAC，引起細胞內(nèi)Ca2+濃度持續(xù)緩慢上升，從而補充胞漿和鈣庫中的Ca2+，維持細胞的興奮性，CRAC是SOC介導的典型Ca2+內(nèi)流。目前細胞生物學的研究確定STIMl(stromalinteraction：molecule1)是偵測胞內(nèi)鈣庫中Ca2+下降從而導致細胞膜CRAC形成的分子。STIM1在多種細胞中表達(包括VSMCs)。Putney等用RNAi技術抑制了STIM1表達后，全細胞電位筘制法也無法

5、測得胞膜上CRAC的形成。STIM1基因位于人的11號染色體上，蛋白分子位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。在此，本研究證明STIM1分子可能在血管平滑肌細胞增殖中有著重要的作用，可能是抑制血管平滑肌細胞增殖新的藥物靶點。 實驗方法： 1、大鼠siRNA靶序列的設計根據(jù)文獻報道選取2條25nt的序列，即STIM11：GCAUGGAAGGCAUCAGAAGUGUAUA；STIM12：GGAUGAGGUGAUACAGUGGCUGAUU，在引物設計時

6、兩端分別加入BamHI和HindIII酶切位點。稀釋退火片段分別與線性化PEGFP6-1、PEGFP6-4載體的連接：STIM11稀釋退火片段與PEGFP6-1載體的連接為STIM11-22；STIM12稀釋退火片段與PEGFP6-4載體的連接為STIM12-4。質(zhì)粒STIM11-22、STIM12-4的SalI+PstI雙酶切分別回收大片段和小片段：STIM11-22回收大片段與STIM12-4回收小片段的連接，篩選后鑒定，將其連接到

7、穿梭質(zhì)粒PGSadeno，包裝重組腺病毒，命名為Ad-si/rSTIM1；人源STIM1(hSTIM1，GenBank NO：U52426)重組腺病毒質(zhì)粒命名為Ad-hSTIM1，由新西蘭奧克蘭大學分子生物實驗室惠贈。純化病毒滴度在109以上，滿足在體轉(zhuǎn)染的要求。 2、在體動物實驗部分：建立球囊損傷模型，用2％戊巴比妥鈉按50mg/kg腹腔注射麻醉。沿頸前正中線切開皮膚，在頸前三角區(qū)暴露左頸總動脈及頸內(nèi)、外動脈，自頸外動脈向近心

8、端插入1.5F球囊導管至頸總動脈起始部，2個大氣壓使球囊膨脹，阻斷血流30秒，后慢速回拉球囊至頸內(nèi)外動脈分叉處，反復3次，退出導管，注入病毒液約10μl，夾閉動脈約10分鐘。結(jié)扎頸外動脈，逐層縫合皮下組織與皮膚，常規(guī)飼養(yǎng)。術后常規(guī)肌注青霉素以預防感染。術后7和14天取頸動脈，中間切片HE染色，圖象分析軟件下計算內(nèi)膜與中膜面積比值。定量RT-PCR和western blot檢測血管組織中STIM1的表達。免疫熒光檢測血管壁STIM1的分布

9、。Western blot來檢測血管壁PCNA表達情況。 3、體外細胞實驗：無菌條件下取大鼠胸主動脈，采用組織貼塊法培養(yǎng)于含20％FBS的DMEM培養(yǎng)液中，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，實驗用4-6代VSMCs；將病毒液加入細胞培養(yǎng)上清中感染細胞，4h后更換培養(yǎng)基，12h后可以看見綠色熒光。采用3H-TdR摻入法和細胞記數(shù)法檢測VSMCs增殖情況。激光共聚焦檢測細胞內(nèi)鈣變化情況。流式細胞儀分析細胞周期情況，并用wester

10、n blot檢測細胞周期蛋白P21和PRb表達情況。。Yranswell小室分析細胞遷移能力。 4、統(tǒng)計學方法：所得結(jié)果用醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)測定其灰度值，所得數(shù)據(jù)用均值±標準差表示。用SPSS13.0對數(shù)據(jù)進行處理，兩組間比較用t檢驗；多組間進行單因素的方差分析，組間比較用Tukey's方法進行。以P<0.05為差異有顯著性。 結(jié)果： 1、成功構(gòu)建了大鼠STIM1基因干擾的腺病毒表達載體；通過反復擴增，病毒滴度約為

11、3×10.pfu/ml。Ad-GFP在體轉(zhuǎn)染后3、7和14天，GFP蛋白水平在3天達到最高，7和14天仍可檢測到表達，這表明構(gòu)建的病毒質(zhì)粒達到在體轉(zhuǎn)染要求。對細胞進行病毒轉(zhuǎn)染后，DAPI染色細胞核，記數(shù)表明轉(zhuǎn)染效率達到92.4±7.6％。質(zhì)粒的成功構(gòu)建魏進一步研究STIM1的生物學作用以及血管平滑肌細胞增殖的內(nèi)在機制奠定了基礎。 2、在體動物實驗部分：血管壁STIM1 mRNA和蛋白表達在血管損傷后7和14天后逐漸升高，與對照組

12、比較有顯著差異(P<0.05)。免疫熒光檢測表明血管壁STIM1表達與血管平滑肌細胞a-actin表達有共區(qū)域性，表明在增殖的平滑肌細胞中STIM1表達上調(diào)。分別用腺病毒陰性對照、Ad-si/rSTIM1及Ad-hSTIM1轉(zhuǎn)染球囊損傷的大鼠頸動脈，在轉(zhuǎn)染后7天和14天處死動物取頸動脈，Western Blotting檢測STIM1表達。結(jié)果表明Ad-si/rSTIM1轉(zhuǎn)染組的STIM1表達較Ad-empty轉(zhuǎn)染組顯著下降(P<0.05

13、)。Ad-hSTIM1和Ad-si/rSTIM1共轉(zhuǎn)染后STIM1恢復至正常水平。轉(zhuǎn)染Ad-si/rSTIM1后內(nèi)膜與中膜(UM)比值較轉(zhuǎn)染陰性對照組明顯減少(P<0.05)。而Ad-hSTIM1和Ad-si/rSTIM1共轉(zhuǎn)染后I/M值恢復到轉(zhuǎn)染對照組水平。免疫組化檢測血管壁PCNA的表達，結(jié)果表明與陰性對照轉(zhuǎn)染組相比，Ad-si/rSTIM1轉(zhuǎn)染組PCNA表達明顯降低(P<0.05)，而Ad-hSTIM1和Ad-si/rSTIM1共

14、轉(zhuǎn)染后PCNA表達恢復到轉(zhuǎn)染Ad-empty組水平。同時，Ad-hSTIM1轉(zhuǎn)染增加了p21表達，降低了pRb表達(P<0.05)，Ad-hSTIM1和Ad-si/rSTIM1共轉(zhuǎn)染恢復到對照組水平。 3、體外細胞實驗部分：分別用不同感染復數(shù)的腺病毒陰性對照、Ad-si/rSTIM1及Ad-hSTIM1轉(zhuǎn)染vMSC，在轉(zhuǎn)染后48h檢測STIM1表達。結(jié)果表明感染復數(shù)為15和30.MOI的Ad-si/rSTIM1轉(zhuǎn)染組的STIM1

15、表達較腺病毒陰性對照轉(zhuǎn)染組顯著下降(P<0.05)。15 MOI的Ad-hSTIM1和15 MOI的Ad-si/rSTIM1共轉(zhuǎn)染后STIM1恢復至正常水平。轉(zhuǎn)染后各組細胞增殖情況：結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染Ad-si/rSTIM1后3H-TdR摻入量較轉(zhuǎn)染腺病毒陰性對照組明顯降低，細胞記數(shù)也明顯減少(P<0.05)。而Ad-hSTIM1和Ad-sir/rSTIM1共轉(zhuǎn)染后3H-TdR摻入量和細胞數(shù)目恢復到轉(zhuǎn)染腺病毒陰性對照組水平，轉(zhuǎn)染后各組細胞內(nèi)C

16、a2+濃度變化的比較：腺病毒轉(zhuǎn)染48h后用1μM TG刺激細胞，使細胞內(nèi)Ca2+耗竭，加入DEME培養(yǎng)基后，觀察細胞內(nèi)Ca2+濃度的變化，取增加值比較。結(jié)果表明與腺病毒陰性對照轉(zhuǎn)染組相比，Ad-si/rSTIMl轉(zhuǎn)染組細胞內(nèi)Ca2+濃度增加幅度明顯減少(P<0.05)，而Ad-hSTIM1和Ad-si/rSTIMl共轉(zhuǎn)染后Ca2+濃度增加幅度恢復到轉(zhuǎn)染腺病毒陰性對照組水平。轉(zhuǎn)染后各組細胞周期分布情況：結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染Ad-si/rSTIM1

17、后細胞分布于G0/G1期的細胞數(shù)目較轉(zhuǎn)染腺病毒陰性對照組明顯增多，S和G2/M期細胞數(shù)目明顯減少(P<0.05)。而Ad-hSTIMl和Ad-si/rSTIM1共轉(zhuǎn)染后細胞周期分布與轉(zhuǎn)染腺病毒陰性對照組無明顯差異。轉(zhuǎn)染后各組細胞p21和pRb表達變化：腺病毒轉(zhuǎn)染48h后對細胞內(nèi)p21和pRb表達進行檢測。結(jié)果表明與腺病毒陰性對照轉(zhuǎn)染組相比，Ad-si/rSTIM1轉(zhuǎn)染組細胞內(nèi)p21表達上調(diào)、pRb表達下調(diào)(P<0.05)，而Ad-hST

18、IM1和Ad-si/rSTIM1共轉(zhuǎn)染后p21和pRb表達恢復到轉(zhuǎn)染腺病毒陰性對照組水平。 結(jié)論： 本研究主要結(jié)論：1、球囊損傷動脈血管后STIM1表達隨著VSMCs增殖逐步升高；2、RNA干擾沉默STIM1表達后顯著抑制了血管損傷后內(nèi)膜增生；3、RNA干擾沉默STIM1表達后可以抑制血清誘導的VSMCs增殖和遷移。這些結(jié)果表明STIM1是調(diào)控血管平滑肌細胞增殖和再狹窄形成的一個關鍵因素，其可能成為治療動脈硬化和再狹窄的