STIM1-SOC細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)機(jī)制在血管平滑肌細(xì)胞增殖中的作用研究.pdf_第1頁(yè)
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1、研究背景: 動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的發(fā)病率呈明顯的增長(zhǎng)趨勢(shì),給人類的健康帶來(lái)嚴(yán)重的威脅。動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程的特點(diǎn)是單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞被招募到血管內(nèi)膜,隨后誘導(dǎo)血管中層血管平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜遷移并增殖,引起血管腔狹窄導(dǎo)致病變發(fā)展。近年來(lái),冠脈介入治療臨床應(yīng)用給冠心病患者帶來(lái)了福音,但術(shù)后再狹窄也嚴(yán)重影響著冠脈介入治療的遠(yuǎn)期效果,研究證實(shí)VSMCs過(guò)度增殖是導(dǎo)致冠脈介入術(shù)后再狹窄的主要原因。由此看出:VSMCs過(guò)度增殖在動(dòng)脈粥樣硬化和冠脈介

2、入術(shù)后再狹窄中都有著重要的作用,然而起增殖的內(nèi)在機(jī)制目前尚未完全闡明。 基礎(chǔ)研究表明Ca2+是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的重要物質(zhì)基礎(chǔ),去除細(xì)胞外鈣后細(xì)胞增殖被明顯抑制。VSMCs胞內(nèi)Ca2+的調(diào)節(jié)依賴于Ca2+跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)與細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)釋放和再攝取Ca2+等過(guò)程。在VSMCs胞膜上有兩種鈣內(nèi)流:1、由電壓門控鈣通道介導(dǎo)的鈣內(nèi)流,電壓門控鈣通道介導(dǎo)的鈣內(nèi)流可以引起VSMCs中Ca2+濃度的迅速增加,從而引起VSMCs的收縮;2、由鈣庫(kù)操縱型鈣通道介

3、導(dǎo)的鈣庫(kù)Ca2+釋放激活的Ca2+內(nèi)流。研究表明在VSMCs在疾病狀態(tài)下發(fā)生表型轉(zhuǎn)換后,電壓門控鈣通道相關(guān)蛋白的表達(dá)逐漸下調(diào)。那么在這種狀態(tài)下,是什么Ca2+通道介導(dǎo)細(xì)胞的Ca2+內(nèi)流?近年來(lái)研究證明由SOC引發(fā)的胞漿內(nèi)Ca2+濃度持續(xù)緩慢上升是細(xì)胞增殖的關(guān)鍵因素,在VSMCs上也發(fā)現(xiàn)了SOC通道的存在。 SOC激活機(jī)制是:外來(lái)刺激通過(guò)IP3和蘭尼定受體途徑引發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)中Ca2+的釋放,當(dāng)胞內(nèi)鈣庫(kù)中Ca2+的濃度下降到一定程

4、度時(shí),細(xì)胞膜上SOC開放產(chǎn)生CRAC,引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度持續(xù)緩慢上升,從而補(bǔ)充胞漿和鈣庫(kù)中的Ca2+,維持細(xì)胞的興奮性,CRAC是SOC介導(dǎo)的典型Ca2+內(nèi)流。目前細(xì)胞生物學(xué)的研究確定STIMl(stromalinteraction:molecule1)是偵測(cè)胞內(nèi)鈣庫(kù)中Ca2+下降從而導(dǎo)致細(xì)胞膜CRAC形成的分子。STIM1在多種細(xì)胞中表達(dá)(包括VSMCs)。Putney等用RNAi技術(shù)抑制了STIM1表達(dá)后,全細(xì)胞電位筘制法也無(wú)法

5、測(cè)得胞膜上CRAC的形成。STIM1基因位于人的11號(hào)染色體上,蛋白分子位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。在此,本研究證明STIM1分子可能在血管平滑肌細(xì)胞增殖中有著重要的作用,可能是抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖新的藥物靶點(diǎn)。 實(shí)驗(yàn)方法: 1、大鼠siRNA靶序列的設(shè)計(jì)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道選取2條25nt的序列,即STIM11:GCAUGGAAGGCAUCAGAAGUGUAUA;STIM12:GGAUGAGGUGAUACAGUGGCUGAUU,在引物設(shè)計(jì)時(shí)

6、兩端分別加入BamHI和HindIII酶切位點(diǎn)。稀釋退火片段分別與線性化PEGFP6-1、PEGFP6-4載體的連接:STIM11稀釋退火片段與PEGFP6-1載體的連接為STIM11-22;STIM12稀釋退火片段與PEGFP6-4載體的連接為STIM12-4。質(zhì)粒STIM11-22、STIM12-4的SalI+PstI雙酶切分別回收大片段和小片段:STIM11-22回收大片段與STIM12-4回收小片段的連接,篩選后鑒定,將其連接到

7、穿梭質(zhì)粒PGSadeno,包裝重組腺病毒,命名為Ad-si/rSTIM1;人源STIM1(hSTIM1,GenBank NO:U52426)重組腺病毒質(zhì)粒命名為Ad-hSTIM1,由新西蘭奧克蘭大學(xué)分子生物實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。純化病毒滴度在109以上,滿足在體轉(zhuǎn)染的要求。 2、在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分:建立球囊損傷模型,用2%戊巴比妥鈉按50mg/kg腹腔注射麻醉。沿頸前正中線切開皮膚,在頸前三角區(qū)暴露左頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)、外動(dòng)脈,自頸外動(dòng)脈向近心

8、端插入1.5F球囊導(dǎo)管至頸總動(dòng)脈起始部,2個(gè)大氣壓使球囊膨脹,阻斷血流30秒,后慢速回拉球囊至頸內(nèi)外動(dòng)脈分叉處,反復(fù)3次,退出導(dǎo)管,注入病毒液約10μl,夾閉動(dòng)脈約10分鐘。結(jié)扎頸外動(dòng)脈,逐層縫合皮下組織與皮膚,常規(guī)飼養(yǎng)。術(shù)后常規(guī)肌注青霉素以預(yù)防感染。術(shù)后7和14天取頸動(dòng)脈,中間切片HE染色,圖象分析軟件下計(jì)算內(nèi)膜與中膜面積比值。定量RT-PCR和western blot檢測(cè)血管組織中STIM1的表達(dá)。免疫熒光檢測(cè)血管壁STIM1的分布

9、。Western blot來(lái)檢測(cè)血管壁PCNA表達(dá)情況。 3、體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn):無(wú)菌條件下取大鼠胸主動(dòng)脈,采用組織貼塊法培養(yǎng)于含20%FBS的DMEM培養(yǎng)液中,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)用4-6代VSMCs;將病毒液加入細(xì)胞培養(yǎng)上清中感染細(xì)胞,4h后更換培養(yǎng)基,12h后可以看見綠色熒光。采用3H-TdR摻入法和細(xì)胞記數(shù)法檢測(cè)VSMCs增殖情況。激光共聚焦檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣變化情況。流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期情況,并用wester

10、n blot檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白P21和PRb表達(dá)情況。。Yranswell小室分析細(xì)胞遷移能力。 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:所得結(jié)果用醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測(cè)定其灰度值,所得數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用SPSS13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,兩組間比較用t檢驗(yàn);多組間進(jìn)行單因素的方差分析,組間比較用Tukey's方法進(jìn)行。以P<0.05為差異有顯著性。 結(jié)果: 1、成功構(gòu)建了大鼠STIM1基因干擾的腺病毒表達(dá)載體;通過(guò)反復(fù)擴(kuò)增,病毒滴度約為

11、3×10.pfu/ml。Ad-GFP在體轉(zhuǎn)染后3、7和14天,GFP蛋白水平在3天達(dá)到最高,7和14天仍可檢測(cè)到表達(dá),這表明構(gòu)建的病毒質(zhì)粒達(dá)到在體轉(zhuǎn)染要求。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染后,DAPI染色細(xì)胞核,記數(shù)表明轉(zhuǎn)染效率達(dá)到92.4±7.6%。質(zhì)粒的成功構(gòu)建魏進(jìn)一步研究STIM1的生物學(xué)作用以及血管平滑肌細(xì)胞增殖的內(nèi)在機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 2、在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分:血管壁STIM1 mRNA和蛋白表達(dá)在血管損傷后7和14天后逐漸升高,與對(duì)照組

12、比較有顯著差異(P<0.05)。免疫熒光檢測(cè)表明血管壁STIM1表達(dá)與血管平滑肌細(xì)胞a-actin表達(dá)有共區(qū)域性,表明在增殖的平滑肌細(xì)胞中STIM1表達(dá)上調(diào)。分別用腺病毒陰性對(duì)照、Ad-si/rSTIM1及Ad-hSTIM1轉(zhuǎn)染球囊損傷的大鼠頸動(dòng)脈,在轉(zhuǎn)染后7天和14天處死動(dòng)物取頸動(dòng)脈,Western Blotting檢測(cè)STIM1表達(dá)。結(jié)果表明Ad-si/rSTIM1轉(zhuǎn)染組的STIM1表達(dá)較Ad-empty轉(zhuǎn)染組顯著下降(P<0.05

13、)。Ad-hSTIM1和Ad-si/rSTIM1共轉(zhuǎn)染后STIM1恢復(fù)至正常水平。轉(zhuǎn)染Ad-si/rSTIM1后內(nèi)膜與中膜(UM)比值較轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組明顯減少(P<0.05)。而Ad-hSTIM1和Ad-si/rSTIM1共轉(zhuǎn)染后I/M值恢復(fù)到轉(zhuǎn)染對(duì)照組水平。免疫組化檢測(cè)血管壁PCNA的表達(dá),結(jié)果表明與陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組相比,Ad-si/rSTIM1轉(zhuǎn)染組PCNA表達(dá)明顯降低(P<0.05),而Ad-hSTIM1和Ad-si/rSTIM1共

14、轉(zhuǎn)染后PCNA表達(dá)恢復(fù)到轉(zhuǎn)染Ad-empty組水平。同時(shí),Ad-hSTIM1轉(zhuǎn)染增加了p21表達(dá),降低了pRb表達(dá)(P<0.05),Ad-hSTIM1和Ad-si/rSTIM1共轉(zhuǎn)染恢復(fù)到對(duì)照組水平。 3、體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分:分別用不同感染復(fù)數(shù)的腺病毒陰性對(duì)照、Ad-si/rSTIM1及Ad-hSTIM1轉(zhuǎn)染vMSC,在轉(zhuǎn)染后48h檢測(cè)STIM1表達(dá)。結(jié)果表明感染復(fù)數(shù)為15和30.MOI的Ad-si/rSTIM1轉(zhuǎn)染組的STIM1

15、表達(dá)較腺病毒陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組顯著下降(P<0.05)。15 MOI的Ad-hSTIM1和15 MOI的Ad-si/rSTIM1共轉(zhuǎn)染后STIM1恢復(fù)至正常水平。轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞增殖情況:結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染Ad-si/rSTIM1后3H-TdR摻入量較轉(zhuǎn)染腺病毒陰性對(duì)照組明顯降低,細(xì)胞記數(shù)也明顯減少(P<0.05)。而Ad-hSTIM1和Ad-sir/rSTIM1共轉(zhuǎn)染后3H-TdR摻入量和細(xì)胞數(shù)目恢復(fù)到轉(zhuǎn)染腺病毒陰性對(duì)照組水平,轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞內(nèi)C

16、a2+濃度變化的比較:腺病毒轉(zhuǎn)染48h后用1μM TG刺激細(xì)胞,使細(xì)胞內(nèi)Ca2+耗竭,加入DEME培養(yǎng)基后,觀察細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化,取增加值比較。結(jié)果表明與腺病毒陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組相比,Ad-si/rSTIMl轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加幅度明顯減少(P<0.05),而Ad-hSTIM1和Ad-si/rSTIMl共轉(zhuǎn)染后Ca2+濃度增加幅度恢復(fù)到轉(zhuǎn)染腺病毒陰性對(duì)照組水平。轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞周期分布情況:結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染Ad-si/rSTIM1

17、后細(xì)胞分布于G0/G1期的細(xì)胞數(shù)目較轉(zhuǎn)染腺病毒陰性對(duì)照組明顯增多,S和G2/M期細(xì)胞數(shù)目明顯減少(P<0.05)。而Ad-hSTIMl和Ad-si/rSTIM1共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞周期分布與轉(zhuǎn)染腺病毒陰性對(duì)照組無(wú)明顯差異。轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞p21和pRb表達(dá)變化:腺病毒轉(zhuǎn)染48h后對(duì)細(xì)胞內(nèi)p21和pRb表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明與腺病毒陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組相比,Ad-si/rSTIM1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)p21表達(dá)上調(diào)、pRb表達(dá)下調(diào)(P<0.05),而Ad-hST

18、IM1和Ad-si/rSTIM1共轉(zhuǎn)染后p21和pRb表達(dá)恢復(fù)到轉(zhuǎn)染腺病毒陰性對(duì)照組水平。 結(jié)論: 本研究主要結(jié)論:1、球囊損傷動(dòng)脈血管后STIM1表達(dá)隨著VSMCs增殖逐步升高;2、RNA干擾沉默STIM1表達(dá)后顯著抑制了血管損傷后內(nèi)膜增生;3、RNA干擾沉默STIM1表達(dá)后可以抑制血清誘導(dǎo)的VSMCs增殖和遷移。這些結(jié)果表明STIM1是調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞增殖和再狹窄形成的一個(gè)關(guān)鍵因素,其可能成為治療動(dòng)脈硬化和再狹窄的

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