酸敏感離子通道阻斷劑阿米洛利對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)作用及部分機(jī)制研究.pdf

1、目的：闡明酸敏感離子通道阻斷劑阿米洛利（Amiloride）對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎（adjuvant arthritis，AA）大鼠關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)作用；從軟骨細(xì)胞凋亡的角度，研究Amiloride對(duì)AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)作用可能的環(huán)節(jié)；通過(guò)檢測(cè)Amiloride對(duì)AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外游離鈣離子濃度、鈣離子依賴(lài)的凋亡相關(guān)酶類(lèi)表達(dá)的變化，分析Amiloride抑制AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡可能的作用機(jī)制。
　　 方法：將大鼠隨機(jī)分為正常組、

2、AA模型組、Amiloride（2.5、5.0、10.0 mg·kg-1·d-1）組和阿司匹林（50 mg/kg）對(duì)照組。弗氏完全佐劑(CFA)致AA后第10天，大鼠出現(xiàn)繼發(fā)性炎癥，此時(shí)Amiloride、阿司匹林灌胃給藥，連續(xù)8 d；正常組與模型組給予等容量的無(wú)菌注射用水。檢測(cè)大鼠繼發(fā)側(cè)關(guān)節(jié)腫脹度變化，光學(xué)顯微鏡觀(guān)察關(guān)節(jié)病理變化，免疫組織化學(xué)技術(shù)測(cè)定Amiloride對(duì)AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨中的Ⅱ型膠原（COII）蛋白合成的影響，Alcia

3、n染色測(cè)定Amiloride對(duì)AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨中的蛋白多糖（PG）合成的影響，透射電鏡、Tunel法觀(guān)察Amiloride對(duì)AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的影響。膠原酶-胰蛋白酶消化法分離培養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，胞外酸化誘導(dǎo)建立AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡體外模型，TUNEL染色及PI單染色法觀(guān)察AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡，鈣離子成像技術(shù)檢測(cè)[Ca2+]I水平，免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞calpain、calcineurin、iNOS的表

4、達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.酸敏感離子通道阻斷劑阿米洛利（Amiloride）對(duì)AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)作用Amiloride各劑量組對(duì)AA大鼠炎癥繼發(fā)側(cè)關(guān)節(jié)足腫脹未見(jiàn)明顯影響；病理學(xué)觀(guān)察關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，軟骨細(xì)胞層次尚清晰，成熟軟骨細(xì)胞數(shù)量增加；免疫組化及Alcian染色檢測(cè)顯示關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)成分COII蛋白和PG的表達(dá)量增加。
　　 2.酸敏感離子通道阻斷劑阿米洛利（Amiloride）對(duì)AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋

5、亡的影響體內(nèi)實(shí)驗(yàn)透射電鏡觀(guān)察Amiloride各劑量組軟骨細(xì)胞核內(nèi)異染色質(zhì)輕度邊集、細(xì)胞內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張、線(xiàn)粒體輕度腫脹，與模型組軟骨細(xì)胞核膜皺縮、核染色質(zhì)高度邊集、核膜破裂、出現(xiàn)凋亡小體相比無(wú)明顯細(xì)胞凋亡的特征；Tunel法原位檢測(cè)顯示凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.01)。體外實(shí)驗(yàn)PI染色發(fā)現(xiàn)Amiloride各給藥組及PcTx1組細(xì)胞凋亡率與模型組相比明顯降低；Tunel法原位檢測(cè)顯示Amiloride各劑量組及PcTx1組凋

6、亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少。
　　 3.酸敏感離子通道阻斷劑阿米洛利（Amiloride）對(duì)AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞游離鈣(ionized free calcium，Ca2+)水平及鈣離子依賴(lài)性的凋亡相關(guān)酶類(lèi)表達(dá)的影響鈣成像結(jié)果顯示Amiloride及PcTx1給藥劑量組胞質(zhì)Ca2+F340/F380比值相對(duì)于模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示Amiloride組鈣離子依賴(lài)性的凋亡相關(guān)酶類(lèi)calpain、calcineurin、

7、iNOS的表達(dá)明顯降低(P<0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1.在佐劑性關(guān)節(jié)炎中，ASICs阻斷劑Amiloride，對(duì)其炎癥反應(yīng)并無(wú)明顯的抑制作用，而對(duì)軟骨細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)有保護(hù)作用。酸敏感離子通道阻斷劑阿米洛利（Amiloride）對(duì)AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨有保護(hù)作用。
　　 2.酸敏感離子通道阻斷劑阿米洛利（Amiloride）對(duì)于AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞以及經(jīng)胞外酸化處理的體外培養(yǎng)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡均有抑制作用。

8、Amiloride是通過(guò)阻斷ASICs來(lái)抑制AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡，從而發(fā)揮對(duì)AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用的。
　　 3.酸敏感離子通道阻斷劑阿米洛利（Amiloride）對(duì)[Ca2+]I的升高以及鈣離子依賴(lài)性的凋亡相關(guān)酶類(lèi)calpain、calcineurin、iNOS的表達(dá)有抑制作用。Amiloride對(duì)于AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡的抑制有可能是通過(guò)阻斷ASICs，抑制Ca2+超載，從而抑制鈣離子依賴(lài)性的凋亡相關(guān)酶類(lèi)c