LuxS-AI-2密度感應(yīng)信號(hào)影響草綠色鏈球菌生物膜致病力的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)方面進(jìn)行論述：
　　第1章 VS多藥耐藥野生株的分離與鑒定
　　目的：獲得研究所需目標(biāo)菌株——草綠色鏈球菌多藥耐藥臨床分離野生株。
　　方法：臨床標(biāo)本通過(guò)血平板培養(yǎng)、革蘭染色、藥敏試驗(yàn)篩選出疑似目標(biāo)菌株;純培養(yǎng)后行生理、生化試驗(yàn)，提取細(xì)菌基因DNA，多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增16SrDNA，測(cè)序后上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)與已知序列比較，行16S rDNA序列同源性分析。
　　結(jié)果：臨床分離多藥耐藥

2、野生株(327045號(hào))，革蘭染色陽(yáng)性鏈球菌;α溶血;生化實(shí)驗(yàn)提示D群鏈球菌，緩癥鏈球菌可能性大;16S rDNA序列同源性分析顯示與緩癥鏈球菌(S.mitis)同源性最高，99.58％。
　　結(jié)論:臨床分離野生株(327045號(hào))屬于草綠色鏈球菌多藥耐藥野生株。成功獲得本研究所需目標(biāo)菌株。
　　第2章 VS多藥耐藥野生株的致病力檢測(cè)
　　目的:了解目標(biāo)菌株——草綠色鏈球菌多藥耐藥臨床分離野生株的致病力，為下一步比較實(shí)

3、驗(yàn)獲取基線數(shù)據(jù)。
　　方法:通過(guò)野生株上清液誘導(dǎo)V.harveyiBB170報(bào)告菌株生物發(fā)光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)VS多藥耐藥野生株AI-2信號(hào)分子的存在與活性;酶標(biāo)儀測(cè)量VS多藥耐藥野生株形成生物膜的吸光光度值，了解其生物膜形成能力;定量分析不同時(shí)間、不同類型、不同濃度抗生素對(duì)VS野生株生物膜形成量的影響，了解其耐藥性，數(shù)據(jù)輸入SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，進(jìn)行析因資料方差分析和單因素方差分析;Fluorecein Stain、18909 Ca

4、lcofluor White Stain、DEAD/LIVE Backlight Bacteria Viability stain熒光染色后，激光共聚焦顯微鏡掃描觀測(cè)VS多藥耐藥野生株生物膜結(jié)構(gòu)、胞外多糖分布、死活菌分布，全面了解VS多藥耐藥野生株的致病力表型。
　　結(jié)果:析因資料方差分析顯示抗生素種類與濃度(P=0.034)、抗生素種類與干預(yù)時(shí)間(P＜0.001)、抗生素濃度與干預(yù)時(shí)間(P=0.010)皆存在交互作用;主效應(yīng)分析

5、顯示抗生素類型(P＜0.001)、抗生素濃度(P＜0.001)、干預(yù)時(shí)間(P＜0.001)均可影響VS多藥耐藥野生株的BF形成。經(jīng)單因素方差分析Dunnett t-tests多重比較顯示初始期，環(huán)丙沙星耐藥濃度(P=0.001)、中敏濃度(P＜0.001)、敏感濃度(P＜0.001)，四環(huán)素耐藥濃度(P=0.012)、中敏濃度(P=0.009)、敏感濃度(P=0.001)實(shí)驗(yàn)組中抗生素均有效減少了VS多藥耐藥野生株BF的形成;中間指數(shù)期

6、，實(shí)驗(yàn)組BF形成量與菌液對(duì)照組均不存在顯著性差異(P＞0.05)。生物膜結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且不均一;胞外多糖、死活菌分布特點(diǎn)多樣，可受抗生素干預(yù)因素影響。
　　結(jié)論:VS多藥耐藥野生株具有極強(qiáng)的生物膜形成能力和多重耐藥性，致病力高，值得臨床關(guān)注;抗生素治療應(yīng)遵循實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果。
　　第3章 VS LuxS基因突變株的構(gòu)建
　　目的:通過(guò)同源重組法敲除VS多藥耐藥野生株的LuxS基因，構(gòu)建VS LuxS基因突變株，為進(jìn)一步研究L

7、uxS基因在VS生物膜形成與耐藥性變化中的作用做準(zhǔn)備。
　　方法:運(yùn)用同源重組法設(shè)計(jì)合成引物，分別以質(zhì)粒PMG36E、VS多藥耐藥野生株(327045)DNA為模板，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增得到紅霉素抗性(Erm.)基因DNA片斷和LuxS基因上下游序列，經(jīng)雙酶切反應(yīng)插入pUC19質(zhì)粒的多克隆酶切位點(diǎn)中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，氨芐青霉和紅霉素培養(yǎng)基篩選，將載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到含完整LuxS基因的VS多藥耐藥野生株(327045)

8、中，利用紅霉素抗性培養(yǎng)基篩選出LuxS基因缺陷突變株，并利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)。
　　結(jié)果:PCR凝膠電泳結(jié)果顯示:紅霉素抗性基因和LuxS基因兩側(cè)同源序列成功連入到Puc19質(zhì)粒相應(yīng)酶切位點(diǎn)，VS LuxS基因突變株LuxS基因完全被紅霉素抗性(Erm.)基因所取代。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建VS LuxS突變株。
　　第4章 LuxS基因缺失對(duì)VS野生株致病力的影響
　　目的:了解LuxS/AI-2密度感

9、應(yīng)信號(hào)缺失對(duì)VS多藥耐藥野生株生物膜致病力的影響，嘗試探討可能存在的機(jī)制。
　　方法:V.harveyi BB170報(bào)告菌株生物發(fā)光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AI-2信號(hào)分子的存在與活性;吸光光度值定量分析VS多藥耐藥野生株與LuxS基因突變株生物膜形成量與耐藥性差異;Fluorecein Stain、18909 CalcofluorWhite Stain、DEAD/LIVE Backlight Bacteria Viability stain熒光

10、染色后，激光共聚焦顯微鏡掃描VS多藥耐藥野生株與LuxS基因突變株BF，比較二者在生物膜結(jié)構(gòu)、胞外多糖分布、死活菌分布方面的差異;通過(guò)野生株上清液、DPD補(bǔ)償生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)VS突變株表型發(fā)生的原因。數(shù)據(jù)輸入SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，進(jìn)行Kolmogorov-Smirno test非參數(shù)檢驗(yàn)。
　　結(jié)果:Kolmogorov-Smirno test顯示:VS LuxS基因突變株與野生株菌液BF形成量存在顯著性差異(P＜0.001);

11、同樣條件下，氨芐西林(P＜0.001)、環(huán)丙沙星（P＜0.05）、四環(huán)素(P＜0.001)干預(yù)VS LuxS基因突變株與野生株BF形成量均存在顯著性差異。突變株菌液BF形成量與VS野生株上清液、DPD補(bǔ)償實(shí)驗(yàn)組BF形成量，均存在顯著性差異（P＜0.001）;野生株菌液BF形成量與VS野生株上清液(P=0.320)、DPD(P=0.683)補(bǔ)償生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)組BF形成量均不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。VS LuxS基因突變株生物膜形成量減少，結(jié)構(gòu)疏松改變，