NF-κB和AP-1參與低氧誘導(dǎo)大鼠CRHR1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié).pdf

1、低氧應(yīng)激是應(yīng)激的重要形式之一。為適應(yīng)低氧環(huán)境、進(jìn)行自我保護(hù)，機(jī)體形成了在不同氧環(huán)境下的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制。促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(Corticotropin-releasinghormone，CRH)家族在機(jī)體低氧應(yīng)激過程中通過調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)(hypothalamuspituitaryadrenal，HPA)軸、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)、自主神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)功能，參與調(diào)節(jié)機(jī)體的低氧應(yīng)激過程，進(jìn)而穩(wěn)定機(jī)體內(nèi)環(huán)境。促腎上腺皮質(zhì)激素釋放

2、激素1型受體(Corticotropinreleasinghormonereceptor1，CRHR1)介導(dǎo)CRH生理作用的發(fā)揮，其基因表達(dá)調(diào)控是應(yīng)激誘導(dǎo)HPA軸反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。我們實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)低氧應(yīng)激激活HPA軸，誘導(dǎo)大鼠等動(dòng)物腦不同部位以及腺垂體CRHR1mRNA表達(dá)上調(diào)，提示低氧下轉(zhuǎn)錄因子可能通過與其作用元件結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控CRHR1mRNA的表達(dá)。本研究旨在探討低氧應(yīng)激下NF-κB和AP-1參與CRHR1轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的機(jī)制

3、。
　　 研究方法
　　 將大鼠垂體CRHR1基因5’調(diào)控區(qū)-2161～+347段不同長度DNA序列亞克隆入不含啟動(dòng)子的螢光素酶載體pGL3中，構(gòu)建各種質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染AtT20細(xì)胞，檢測(cè)其活性與內(nèi)參pRL-TK螢光素酶活性比值；利用整體間歇低氧應(yīng)激動(dòng)物模型，研究低氧誘導(dǎo)大鼠垂體CRHR1基因表達(dá)變化；應(yīng)用EMSA方法檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子在體外與靶序列結(jié)合活性；應(yīng)用定量RealtimePCR方法檢測(cè)整體水平CRHR1mRNA的表達(dá)。<

4、br>　　 研究結(jié)果如下：
　　 1.獲得大鼠垂體CRHR1基因5’調(diào)控區(qū)-2161～+347段DNA序列，全長為2508bp，經(jīng)過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)該序列分別含有5個(gè)c-jun/AP-1，3個(gè)GR，4個(gè)NF-κB以及8個(gè)HIF-1結(jié)合位點(diǎn)。
　　 2.成功構(gòu)建質(zhì)粒p2161-18T和p2161Luc，分別用于測(cè)序和檢測(cè)CRHR1基因5’端調(diào)控區(qū)轉(zhuǎn)錄活性。根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件在CRHR1基因5'調(diào)控區(qū)-2161～+3

5、47段的分布，又分別構(gòu)建了p1833Luc、p1795Luc、p1692Luc、p1289Luc、p1248Luc、p1218Luc、p1140Luc、p838Luc、p687Luc、p360Luc等系列缺失體質(zhì)粒。進(jìn)一步構(gòu)建了含-809～-800位點(diǎn)的NF-κB結(jié)合元件的突變體質(zhì)粒p838mLuc和含有-1277～1271位點(diǎn)的c-jun/AP-1結(jié)合元件的突變體質(zhì)粒p1289mLuc和以及c-jun的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-c

6、-jun。
　　 3.發(fā)現(xiàn)p2161Luc、p1289Luc、p838Luc在AtT20細(xì)胞中的活性隨低氧時(shí)間延長而呈現(xiàn)增強(qiáng)的趨勢(shì)，在24小時(shí)達(dá)到最大值。p2161Luc和p1289Luc的活性在低氧暴露8-12小時(shí)期間曲線平緩。
　　 4.發(fā)現(xiàn)低氧暴露24小時(shí)，p838Luc在AtT20細(xì)胞中的活性與常氧對(duì)照組相比顯著增強(qiáng)，這一現(xiàn)象可以被NF-κB抑制劑(PDTC)抑制；而突變體p838mLuc活性無明顯增強(qiáng)。大鼠垂體

7、CRHR1基因5’調(diào)控區(qū)-809～-800區(qū)域的結(jié)合元件在體外能與AtT20細(xì)胞以及大鼠垂體的核蛋白中的NF-κB結(jié)合，且低氧進(jìn)一步增強(qiáng)二者結(jié)合活性，此結(jié)合可以被PDTC、p65抗體、100倍濃度的冷探針消除；突變探針(-809～-800)不再與NF-κB結(jié)合。在整體低壓艙模擬5km間歇低氧(10.8％O2，4h/d)條件下，CRHR1mRNA表達(dá)表現(xiàn)為一個(gè)先下降后增強(qiáng)的過程，在第2天表達(dá)顯著下降，第5天表達(dá)上升，二者均可被PDTC反轉(zhuǎn)

8、；7km(7.8%O2)連續(xù)低氧8h，CRHR1mRNA表達(dá)下降幅度更大，此結(jié)果同樣可被PDTC反轉(zhuǎn)。
　　 5.發(fā)現(xiàn)大鼠垂體CRHR1基因5’調(diào)控區(qū)-1277～1271區(qū)域的結(jié)合元件在體外能與AtT20細(xì)胞核蛋白中的c-jun/AP-1結(jié)合，低氧暴露進(jìn)一步增強(qiáng)二者結(jié)合活性，此結(jié)合可以被c-jun磷酸化抗體、100倍濃度的冷探針消除。突變探針(-1277～1271)不再與c-jun/AP-1結(jié)合。p1289Luc轉(zhuǎn)染AtT20細(xì)

9、胞，低氧暴露24h后，CRHR1基因5'調(diào)控區(qū)-1289～+347段的轉(zhuǎn)錄活性較常氧對(duì)照組增幅達(dá)到最大，此增幅可以被2μgpcDNA3.1-c-jun的共表達(dá)完全抑制。
　　 結(jié)論
　　 1.CRFR1基因5'調(diào)控區(qū)-2161～+347參與低氧上調(diào)CRFR1基因轉(zhuǎn)錄。
　　 2.證明了大鼠垂體CRHR1基因5’調(diào)控區(qū)-809～-800位點(diǎn)的NF-κB結(jié)合元件促進(jìn)低氧誘導(dǎo)的大鼠垂體CRHR1基因的轉(zhuǎn)錄。