3-磷酸甘油醛脫氫酶胞漿聚集及核轉(zhuǎn)位在帕金森病發(fā)病機制中作用的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 魚藤酮誘導(dǎo) SH-SY5Y細胞帕金森病模型的建立
　　第一節(jié) 魚藤酮對 SH-SY5Y細胞的影響
　　目的：研究魚藤酮對人神經(jīng)母細胞瘤細胞 SH-SY5Y的影響。
　　方法：觀察魚藤酮處理后 SH-SY5Y細胞形態(tài)變化,采用MTT比色法檢測魚藤酮處理對細胞活力的影響,選定魚藤酮干預(yù)濃度;采用吖啶橙(AO)/溴化乙錠(EB)雙熒光染色,在熒光顯微鏡下觀察細胞死亡方式并

2、計算細胞凋亡率。
　　結(jié)果：魚藤酮處理后 SH-SY5Y細胞形態(tài)改變明顯,生長受到抑制,神經(jīng)元突起變短減少,部分細胞圓縮,細胞貼壁能力降低;MTT結(jié)果提示,魚藤酮可濃度依賴性和時間依賴性的降低 SH-SY5Y細胞活力;AO/EB雙熒光染色顯示,魚藤酮誘發(fā)SH-SY5Y細胞的死亡方式以凋亡為主,并時間依賴性和濃度依賴性誘發(fā)細胞凋亡。
　　結(jié)論：魚藤酮能夠時間依賴性和濃度依賴性誘導(dǎo) SH-SY5Y細胞凋亡。
　　第二節(jié) 魚

3、藤酮誘導(dǎo)未分化 SH-SY5Y細胞 PD模型的建立
　　目的：觀察魚藤酮誘導(dǎo)后 SH-SY5Y細胞內(nèi)包涵體的形成及α-突觸核蛋白的表達和定位改變。
　　方法：HE染色觀察魚藤酮處理SH-SY5Y細胞24h和48h后細胞形態(tài)變化及包涵體形成;激光共聚焦熒光顯微鏡觀察魚藤酮誘導(dǎo)后α-突觸核蛋白(α-synuclein)的分布和性狀改變;蛋白免疫印跡分析(Western blot)檢測魚藤酮對 SH-SY5Y細胞內(nèi)α-synucl

4、ein蛋白表達水平的影響。
　　結(jié)果：HE染色,光鏡下見魚藤酮處理后 SH-SY5Y細胞胞體和胞核明顯增大,突起變短減少,胞質(zhì)疏松、空泡化,出現(xiàn)核固縮,胞漿內(nèi)觀察到嗜伊紅、邊界清楚的類路易小體樣包涵體;α-synuclein和Thioflavin S雙熒光染色,在激光共聚焦顯微鏡下觀察,細胞內(nèi)出現(xiàn)顆粒狀α-synuclein免疫染色陽性聚集體,可被 Thioflavin S共定位;Western blot檢測到魚藤酮誘導(dǎo)后細胞內(nèi)α

5、-synuclein表達上調(diào)。
　　結(jié)論：魚藤酮誘導(dǎo) SH-SY5Y細胞后出現(xiàn)嗜酸性包涵體,α-synuclein和Thioflavin S共免疫染色陽性聚集體,及誘發(fā)α-synuclein蛋白表達升高,提示魚藤酮誘導(dǎo) SH-SY5Y細胞能夠很好模擬 PD病理特征,能夠作為神經(jīng)毒素成功建立 PD細胞模型。
　　第二部分 魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞 PD模型中GAPDH表達、分布的變化
　　第一節(jié) 魚藤酮對 SH-S

6、Y5Y細胞中GAPDH表達、亞細胞定位的影響
　　目的：研究魚藤酮對 SH-SY5Y細胞內(nèi) GAPDH的表達、亞細胞定位的影響。
　　方法：使用免疫熒光染色激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內(nèi) GAPDH的分布和亞細胞定位改變;采用蛋白免疫印跡分析(Western blot)和實時熒光定量 PCR(real-time PCR)技術(shù)檢測魚藤酮對 SH-SY5Y細胞內(nèi) GAPDH蛋白和mRNA表達水平的影響。
　　結(jié)果：免疫染色激光

7、共聚焦結(jié)果顯示,魚藤酮處理后,SH-SY5Y細胞胞漿內(nèi) GAPDH染色熒光增強,且出現(xiàn) GAPDH染色陽性顆粒樣聚集體,部分細胞胞核內(nèi) GAPDH分布增多。而正常組 SH-SY5Y細胞內(nèi) GAPDH蛋白在胞漿中均勻分布,胞核內(nèi)僅有少量分布。Western blot及real-time PCR結(jié)果分析顯示,魚藤酮處理后細胞內(nèi) GAPDH蛋白和mRNA水平隨著處理時間延長逐漸升高。
　　結(jié)論：PD細胞模型中,魚藤酮可以導(dǎo)致 GAPDH

8、亞細胞定位及性狀改變,誘發(fā)GAPDH的過表達和異常聚集,這可能是神經(jīng)元凋亡及包涵體形成的重要機制之一。
　　第二節(jié) 魚藤酮誘導(dǎo)后 SH-SY5Y細胞核中GAPDH定位及表達變化
　　目的：探討魚藤酮誘導(dǎo) SH-SY5Y后胞核內(nèi) GAPDH定位及表達變化。
　　方法：魚藤酮誘導(dǎo) SH-SY5Y細胞后免疫熒光染色,使用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內(nèi) GAPDH的表達和定位改變;同時采用免疫組織化學(xué)染色觀察魚藤酮誘導(dǎo)對GAPDH

9、的影響;提取細胞核蛋白,采用蛋白免疫印跡分析(Western blot)檢測細胞核內(nèi) GAPDH的表達變化。
　　結(jié)果：免疫熒光激光共聚焦結(jié)果顯示,正常細胞內(nèi) GAPDH蛋白均勻分布于細胞漿,胞核區(qū)僅有少量分布,魚藤酮處理48h后,部分細胞的胞核區(qū) GAPDH熒光染色增強、濃聚。免疫組化染色光鏡下觀察到魚藤酮處理后細胞 GAPDH染色增強,部分細胞核呈濃染棕色,與免疫熒光染色結(jié)果一致。Western blot結(jié)果也顯示,隨著魚藤酮

10、處理濃度增大細胞核內(nèi) GAPDH的表達量逐漸升高,呈濃度依賴性。以上結(jié)果提示 GAPDH發(fā)生了核轉(zhuǎn)位。
　　結(jié)論：魚藤酮可以導(dǎo)致 GAPDH發(fā)生核轉(zhuǎn)位,隨著處理時間延長和處理濃度增大, GAPDH的核轉(zhuǎn)位增加,提示 GAPDH核轉(zhuǎn)位可能是魚藤酮誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡的重要機制。
　　第三部分 GAPDH胞漿聚集和核轉(zhuǎn)位在魚藤酮誘導(dǎo)的PD細胞模型中的作用機制
　　第一節(jié) GAPDH異常降解對魚藤酮誘導(dǎo)后 SH-SY5Y細胞的影響

11、
　　目的：探討泛素蛋白酶體途徑和自噬溶酶體途徑在 GAPDH蛋白降解中的作用。
　　方法：采用MTT比色法檢測不同藥物(魚藤酮、MG132、3-MA、Rapamycin和MgCl2)干預(yù)對 SH-SY5Y細胞活力的影響,選擇藥物干預(yù)濃度;通過選擇性抑制和激活泛素蛋白酶體途徑和自噬溶酶體途徑兩條降解通路,采用蛋白免疫印跡分析(Western blot)檢測魚藤酮誘導(dǎo)后細胞內(nèi) GAPDH蛋白水平變化。
　　結(jié)果：魚藤酮處

12、理后細胞內(nèi) GAPDH蛋白水平上調(diào),加入蛋白酶體抑制劑 MG132和自噬溶酶體途徑抑制劑3-MA后細胞內(nèi) GAPDH上升更明顯,與對照組比較差異顯著(P<0.05),說明兩條途徑被抑制后增加了細胞內(nèi) GAPDH的含量;加入蛋白酶體促進劑 Mg2+和溶酶體途徑激活劑 Rapamycin后細胞內(nèi) GAPDH水平下調(diào),低于單獨魚藤酮處理組,Mg2+組 GAPDH下降更明顯,與單獨魚藤酮處理組比較差異顯著(P<0.05),說明兩條途徑被激活均可

13、減少細胞內(nèi) GAPDH的含量。
　　結(jié)論：GAPDH不僅通過泛素蛋白酶體途徑降解,也通過自噬溶酶體途徑降解。其中泛素蛋白酶體途徑可能在 GAPDH的降解中起更重要的作用。激活兩條降解通路能夠下調(diào) GAPDH,可能為神經(jīng)保護和PD治療提供新的方向和靶點。
　　第二節(jié) Siah1參與魚藤酮誘導(dǎo)的GAPDH核轉(zhuǎn)位及其下游機制
　　目的：探討 Siah1在 GAPDH核轉(zhuǎn)位中的作用及其促凋亡作用。
　　方法：采用免疫熒光

14、染色激光共聚焦顯微鏡觀察魚藤酮誘導(dǎo) SH-SY5Y細胞后細胞內(nèi)GAPDH和Siah1的表達和定位改變;使用蛋白免疫印跡分析(Western blot)檢測細胞核內(nèi) Siah1的表達變化,分析其與 GAPDH核轉(zhuǎn)位的相關(guān)性。采用Western blot檢測魚藤酮誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元的促凋亡作用。
　　結(jié)果：魚藤酮處理組細胞的胞漿和胞核中GAPDH和Siah1的熒光強度均較對照組增強,兩者共聚焦后胞漿呈明亮黃色,胞核中也出現(xiàn)黃色熒光。W

15、estern blot結(jié)果也顯示魚藤酮誘導(dǎo)后胞核中Siah1表達呈濃度依賴性增加,與 GAPDH變化趨勢一致。魚藤酮誘導(dǎo)后凋亡相關(guān)蛋白總 p53和線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白 Bax也呈濃度依賴性升高。
　　結(jié)論：Siah1參與了魚藤酮誘導(dǎo)的GAPDH核轉(zhuǎn)位,兩者可能在胞漿中結(jié)合,由胞漿向胞核發(fā)生轉(zhuǎn)位,發(fā)揮促凋亡作用。
　　第三節(jié) RNA干擾 Siah1表達對魚藤酮誘導(dǎo)后 GAPDH核轉(zhuǎn)位的影響
　　目的：研究 RNA干擾對

16、 Siah1的表達以及對魚藤酮誘導(dǎo)的GAPDH核轉(zhuǎn)位的影響。
　　方法：使用脂質(zhì)體 Lipofectamine2000將針對 Siah1基因的siRNA轉(zhuǎn)染進入 SH-SY5Y細胞中,使用蛋白免疫印跡法(Western blot)鑒定干擾效果;魚藤酮處理未干擾組和干擾組 SH-SY5Y細胞,提取細胞核蛋白,采用Western blot檢測魚藤酮誘導(dǎo)后未干擾組和干擾組細胞核內(nèi) GAPDH的表達變化。
　　結(jié)果：蛋白免疫印跡結(jié)果