聚乙烯亞胺肝素結(jié)合體外循環(huán)管道的研制與實驗.pdf

1、第一部分肝素結(jié)合體外循環(huán)管道的制備一.聚乙烯亞胺肝素結(jié)合技術(shù)該實驗所用聚乙烯亞胺肝素結(jié)合技術(shù)是先通過聚乙烯亞胺與醫(yī)用材料表面結(jié)合,引入活性氨基,再通過戊二醛與肝素分子的氨基發(fā)生共價鍵結(jié)合,使肝素分子固定于材料表面.此外,由于聚乙烯亞胺分子本身也含有大量負電荷,也可以與肝素分子以離子鍵方式結(jié)合.二.離子鍵結(jié)合肝素結(jié)合技術(shù)根據(jù)分子量和空間結(jié)構(gòu)的不同,選取氯烴基二甲基代苯甲胺、十六烷基三甲基溴化胺(CTMAB)以及苯扎溴胺三種季胺鹽以離子鍵方

2、式與體外循環(huán)管道(醫(yī)用聚氯乙烯、硅橡膠等材料)進行了肝素結(jié)合.三.結(jié)果該部分研究采用了聚乙烯亞胺肝素結(jié)合以及3種離子鍵方法進行了體外循環(huán)管道材料的肝素結(jié)合,制備了肝素結(jié)合的體外循環(huán)管道及動脈微栓濾器.聚乙烯亞胺方法中所采用的PEI表面張力較大,能均勻地分布于所涂覆材料表面,通過戊二醛與肝素分子中的氨基發(fā)生共價鍵結(jié)合,在體外循環(huán)材料表面形成非水溶性分子膜,這樣可使絕大部分戊二醛分子的兩個醛基分別與肝素和聚乙烯亞胺(PEI)反應,形成H-G

3、-PEI復合物,提高交聯(lián)效率.此外,此種方式中聚乙烯亞胺也可以與肝素分子以離子鍵方式結(jié)合,形成H-PEI復合物.離子鍵方法所選用的HBB、HBC以及HCTMAB復合物均能夠溶解于無水乙醇、1,2-二氯乙烷二者的混合物溶液,最佳溶劑組成配比為乙醇∶二氯乙烷=9∶1~3∶1.這種條件下肝素的溶解度較大,同時可避免過渡使用有機溶劑二氯乙烷帶來的毒性副作用.實驗觀察HBB復合物沉淀為絮狀,而HBC和HCTMAB復合物為乳白色細顆粒沉淀,三種物質(zhì)

4、在乙醇中的溶解度比較為HBB>HBC>HCTMAB.隨PH值升高,HBC及H-G-PEI兩種方式的表面結(jié)合肝素量下降,在PH值0-1時獲得的溶解度最大.第二部分肝素結(jié)合體外循環(huán)管道的體外實驗一.實驗方法1紅外光譜分析將不同方法處理的醫(yī)用聚氯乙烯材料剪切至0.2cm2塊狀大小,加入AVATAR 360型紅外光譜儀標本孔中進行紅外光譜分析,并將結(jié)果與純肝素的標準譜圖進行對比分析,了解肝素分子是否結(jié)合于材料表面.2分光光度法測定結(jié)合表面的肝素

5、含量通過甲苯胺藍分光光度法首先繪制肝素標準曲線,甲苯胺藍通過離子鍵吸附在肝素分子上,通過比較吸附前后甲苯胺藍在631nm處吸光度的差值,可得到H-G-PEI結(jié)合法處理的表面肝素含量.3肝素分子釋放速率的檢測將不同方法處理的聚氯乙烯管道剪成0.5cm2大小碎片,室溫下浸泡于生理鹽水中,在不同的浸泡時間取樣,通過甲苯胺藍分光光度法測定生理鹽水中的游離肝素含量,檢測肝素分子的釋放速率.4不同濃度HBC復合物結(jié)合體外循環(huán)管道抗凝血性能測定以HB

6、C復合物作為代表,對不同濃度復合物結(jié)合的體外循環(huán)管道進行了PT及APTT檢測,篩選出合適的結(jié)合濃度.5體外轉(zhuǎn)流對肝素結(jié)合管道抗凝血性能的影響應用體外循環(huán)機建立測試回路,將不同方法處理的體外循環(huán)管道連接于回路中,以4L/min流量進行轉(zhuǎn)流,不同轉(zhuǎn)流時間后進行PT及APTT檢測,評價體外轉(zhuǎn)流對肝素結(jié)合管道抗凝血性能的影響.二.結(jié)果1.紅外光譜分析顯示純肝素在3500cm-1處有明顯吸收峰,四種肝素結(jié)合材料在3500cm-1波長處均有吸收,其

7、中H-G-PEI處理的PVC表面所結(jié)合的肝素分子數(shù)量最多,HBB處理的PVC表面肝素結(jié)合量最少;2.甲苯胺藍分光光度法結(jié)果顯示肝素濃度與甲苯胺藍的光吸收度呈直線正相關(guān).根據(jù)濃度-吸光度公式計算出大多數(shù)HBC結(jié)合管道中肝素的濃度為0.1~0.7mg/cm2,H-G-PEI結(jié)合PVC表面肝素含量范圍為0.6~0.75mg/cm2;3.經(jīng)過700h的浸泡后,HBC方法處理的PVC表面的肝素脫落率為2.77％,而H-G-PEI組的肝素脫落率僅為

8、0.89%,兩者之間有顯著差異;4.綜合PT與APTT指標,質(zhì)量分數(shù)為0.1%-1%的HBC復合物結(jié)合管道具有較好的抗凝血性能,同時可防止?jié)舛冗^大引起的其他副作用.5.經(jīng)過不同轉(zhuǎn)流時間后,HBC結(jié)合和H-G-PEI結(jié)合兩組抗凝血穩(wěn)定性優(yōu)于HBB結(jié)合組和HCTMAB結(jié)合組,在轉(zhuǎn)流96h后仍具有較佳的抗凝血活性,能夠滿足臨床對抗凝血體外循環(huán)管道的需求.第三部分肝素結(jié)合體外循環(huán)管道的生物學評價一.實驗方法1直接接觸細胞培養(yǎng)法評價肝素結(jié)合醫(yī)用材

9、料的細胞毒性將肝素結(jié)合聚氯乙烯和硅橡膠材料剪切成0.7 cm×0.7 cm大小,選用傳代3次后第4天生長旺盛的L-929細胞,與材料直接接觸,觀察細胞的生長情況,評價各種材料的細胞毒性.2四唑鹽(MTT)比色試驗按照《國標—醫(yī)療器械生物學評價》第12部分進行各種材料浸提液的制備,以每孔104個細胞的密度將L-929細胞接種于培養(yǎng)板中,每孔體積200μl,加入不同濃度的各組材料浸提液80μl及陰性、陽性對照液體,逐日在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定

10、每孔光吸收值并繪制細胞生長曲線.3肌肉植入后局部反應試驗按照《國標—醫(yī)療器械生物學評價》第6部分進行:將肝素結(jié)合材料制備成0.3 cm×1.0 cm薄片,植入兔脊柱旁肌內(nèi),于第1、4、12周進行肌肉HE染色,光學顯微鏡下觀察局部組織反應狀況.4皮膚刺激試驗按照《國標—醫(yī)療器械生物學評價》第10部分進行了材料的皮膚刺激試驗和皮內(nèi)反應試驗:將含樣品浸提液的紗布塊敷貼于兔背部去毛區(qū)域,定期觀察接觸部位情況;同時將極性浸提液和非極性浸提液皮內(nèi)注

11、射兔脊柱一側(cè),按規(guī)定的分類系統(tǒng)對每一觀察期各注射部位的紅斑和水腫反應評分.二.結(jié)果:1.直接接觸細胞培養(yǎng)法結(jié)果顯示聚氯乙烯及硅橡膠材料不影響細胞毒性結(jié)果;H-G-PEI結(jié)合的聚氯乙烯及硅橡膠材料細胞毒性輕微,具有較好的細胞相容性;使用HBC復合物、HBB復合物以及HCTMAB結(jié)合的材料(聚氯乙烯及硅橡膠)均顯示較強的細胞毒性;2.MTT試驗結(jié)果顯示H-G-PEI結(jié)合浸提液具有較佳的細胞相容性,而HBC、HBB及HCTMAB組的浸提液影響

12、了細胞的生長.3.肌肉植入后局部反應試驗結(jié)果顯示HBB、HBC及HCTMAB處理的聚氯乙烯和硅橡膠材料組均有中等以上程度的炎癥反應;H-G-PEI處理的材料引起的炎癥反應輕微,植入1月后肌纖維恢復正常,炎細胞少見.4.皮膚刺激試驗結(jié)果表明各組浸提液與皮膚直接接觸后均不引起水腫及紅斑和焦痂形成;各種材料浸提液無產(chǎn)生刺激反應的潛在性.第四部分肝素結(jié)合體外循環(huán)管道的動物實驗一.實驗方法1實驗動物及分組實驗選用健康雜種狗20只,分HBC結(jié)合組(

13、8只)、H-G-PEI結(jié)合組(8只)和對照組(4只).2體外循環(huán)測試回路的建立采用戊巴比妥鈉30mg/kg肌肉注射麻醉,氣管切開外接呼吸機輔助呼吸.左心轉(zhuǎn)流以1.2 L/min的流量輔助循環(huán)3h.3檢測指標檢測指標包括:CPB結(jié)束后組織標本HE染色;管道標本及動脈微栓濾器內(nèi)層制作電鏡標本;炎性介質(zhì)IL-6、IL-8、TNFα的測定;補體C3,C4,CI1的測定,C反應蛋白(CRP)的測定等.二.結(jié)果:1.HE染色結(jié)果顯示肝素結(jié)合與未結(jié)合

14、組動物均出現(xiàn)組織輕度炎癥反應,變性,兩者之間并無明顯差別.2.掃描電鏡觀察結(jié)果顯示H-G-PEI及HBC結(jié)合的體外循環(huán)材料減輕了血小板和纖維蛋白黏附,其中H-G-PEI結(jié)合組的材料表面情況優(yōu)于HBC結(jié)合組.3.炎性介質(zhì)變化結(jié)果表明:經(jīng)過體外轉(zhuǎn)流后,動物體內(nèi)炎性介質(zhì)水平發(fā)生了改變:HBC結(jié)合升高了機體IL-6、IL-8水平;H-G-PEI結(jié)合方法有效減輕了IL-6、IL-8的釋放;兩者對TNFα水平無明顯影響.4.補體指標及C反應蛋白在肝