基于胰島素的I型糖尿病負調肽疫苗的研究.pdf

1、I 型糖尿?。═ype 1diabetes，T1D）是由自身反應性T細胞介導的以胰腺β細胞損傷為主要特征的一種器官特異性自身免疫性疾病。無論在非肥胖糖尿?。╪onobese diabetic，NOD）小鼠還是T1D患者，自身反應性CD8+細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte）是T1D 發(fā)病不可或缺的直接效應細胞。針對β細胞自身反應性T細胞進行特異性的免疫干預與阻斷，重塑機體對β細胞自身抗原的免疫耐受，是一種可

2、能從根本上預防T1D 發(fā)生或發(fā)展的理想策略?？乖禺愋灾委熍c其他形式的治療方案相比，其優(yōu)勢在于無潛在的代謝活性并且能限制目的致病表位肽的反應范圍。愈來愈多證據表明：負向調節(jié)疫苗是針對自身免疫性疾病治療的一種非常有效的抗原特異性免疫調節(jié)劑。它通常是根據天然表位肽人工修飾設計合成，能特異性下調致病自身反應性T細胞應答效應的拮抗型改造肽(altered peptide ligands,APL)。大量研究結果提示，反復給予天然肽或拮抗型表位改造

3、肽可通過誘導自身反應性CD8+T細胞克隆無能或活化后凋亡（AICD）從而實現(xiàn)特異性的免疫耐受。
　　 改造肽是在天然表位肽的基礎上對表位進行氨基酸改造形成的具有更高穩(wěn)定性和免疫調節(jié)活性的短肽。目前常用的APL 設計方法包括：1.TCR 結合位點的替換；
　　 2.MHC-I 類分子錨著殘基替換；3.殘基的特殊修飾，已成功應用于其他自身免疫疾病如多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)負調疫苗的治療研究中。

4、
　　 胰島素是啟動T1D 唯一所必需的關鍵靶抗原，胰島素特異性CD8+T細胞被發(fā)現(xiàn)是在T1D患者和NOD小鼠中最早浸潤至胰島的CD8+T細胞，它通過啟動β細胞損傷，致使β細胞釋放大量危險信號并暴露更多自身抗原，進而通過表位擴展，形成針對更廣泛自身抗原的“瀑布式”自身免疫反應。因此，針對胰島素特異性CD8+T細胞的免疫干預，對于阻斷T1D的自身免疫啟動顯得尤為關鍵。基于能夠模擬T1D患者疾病過程的人源化HLA （human le

5、ucocyte antigen，人白細胞抗原）轉基因NOD小鼠模型（NOD.β2m null HHD），已陸續(xù)鑒定了胰島素來源HLA-A*0201限制性CTL表位，其中胰島素A 鏈2-10(mInsA2-10)和胰島素B 鏈5-14(mInsB5-14)與人胰島素序列高度同源，且具有交叉反應性，為T1D的免疫干預以及將來的臨床轉化研究提供了良好的靶標。本研究根據自身抗原表位肽mInsA2-10和mInsB5-14 設計計算得到若干APL

6、，在多克隆T細胞動物模型NOD.β2m null HHD中篩選得到能下調肽特異性自身免疫性CD8+T細胞應答效應的拮抗型APL，從而得到具有能預防、保護效應的I 型糖尿病負調疫苗。
　　 本文第一部分，我們通過三方面實驗驗證上述兩條已知自身抗原表位的自身反應免疫原性。通過A2分子相對親和力實驗證實該表位是HLA-A*0201限制性的，在人源化NOD小鼠T細胞功能水平通過CTL 效應細胞因子分泌檢測和CFSE 增殖檢測證實：其具備

7、包含特異性分泌IFN-γ以及特異性增殖反應等表位特異性自身反應性。即mInsA2-10、mInsB5-14是具有優(yōu)勢免疫原性的HLA-A*0201限制性自身反應性CD8+T細胞表位。
　　 第二部分，我們通過反復系統(tǒng)性給予可溶性抗原的方式分別將兩種自身抗原肽經腹腔注射給予幼齡小鼠，觀察是否產生保護性預防T1D 發(fā)生的作用。結果，給予可溶性mInsA2-10并不能對人源化NOD小鼠產生保護作用，反而加速了其T1D的疾病進程以及增加

8、發(fā)病率。mInsB5-14 處理組雖然能夠降低人源化NOD小鼠胰腺的病理損傷以并緩解淋巴細胞浸潤程度，以及降低分泌IFN-γ的CTL 頻率，但對T1D 發(fā)病率并沒有顯著的干預作用。
　　 第三部分，我們首先利用InsightII 工作站分別模擬構建表位mInsA2-10與HLA-A2分子的peptide-MHC 三維復合體(mInsA2-10-HLA-A2)。分別通過非天然氨基酸逐個替換的方法和TCR 位點單個天然氨基酸的方法對

9、mInsA2-10與mInsB5-14 進行改造，通過計算各候選APL與HLA分子結合能量變化、RMSD、以及氫鍵數量，初步篩選得到基于mInsA2-10的4 條APL與基于mInsB5-14P6 位點改造的6 條APL作為候選APL用于后續(xù)生物功能的篩選。
　　 通過與HLA-A2分子親和力檢測、CFSE 染色增殖抑制能力分析以及IFN-γ分泌檢測等實驗鑒定候選APL中具有拮抗功能的APL。結果顯示，基于mInsA2-10第4

10、 位點改為D 型谷氨酸的mInsA2-10D-Q4和第6 位點改為D 型半胱氨酸的mInsA2-10D-C6為拮抗型APL，可以明顯下調靶器官胰島浸潤自身反應性CD8+T細胞特異性分泌IFN-γ并抑制CD8+T細胞在mInsA2-10刺激下的增殖反應。根據mInsB5-14 第6 位由組氨酸改為苯丙氨酸的改造肽mInsB5-14H6F 也能顯著下調肽特異性外周自身反應性CD8+T淋巴細胞分泌IFN-γ的應答水平。
　　 綜上，本

11、研究在HLA-A*0201轉基因NOD小鼠模型中驗證了來自鼠胰島素的自身抗原表位mInsA2-10和mInsB5-14是HLA-A*0201限制性免疫優(yōu)勢自身反應性CD8+T細胞表位；發(fā)現(xiàn)通過腹腔注射方式反復給予T1D 相關自身抗原CD8+T細胞表位mInsA2-10或mInsB5-14 并不能夠在該人源化NOD小鼠體內產生預防T1D 發(fā)生的保護效應；通過對mInsA2-10與mInsB5-14 進行計算機輔助模擬氨基酸替換改造，并通過

12、體外細胞功能實驗證實：mInsA2-10D-C6、mInsA2-10D-Q4與mInsB5-14H6F 均為具有負調天然肽特異性CTL 應答功能的拮抗型APL，今后我們將在人源化NOD小鼠模型體內實驗中進一步驗證這三條拮抗型APL的治療效應，從而將這些肽用于抗T1D 治療性疫苗研發(fā)的設計應用當中。本課題所建立的基于分子模擬、分子動力學并結合自由能計算的計算機輔助APL 設計平臺以及利用人源化疾病動物模型的生物學功能篩選體系，可以極大的提