人在體細(xì)樣胞周期核心機(jī)制多性.pdf

1、第一部分
　　 目的：將正常的胃、腸及口腔黏膜上皮組織制備成高質(zhì)量的單細(xì)胞懸液，可供流式細(xì)胞儀檢測(cè)；并建立人類(lèi)在體細(xì)胞的細(xì)胞增殖周期研究模型。
　　 方法：應(yīng)用不同濃度的胃蛋白酶和Dispase嘗試去除胃、腸、口腔粘液和分離獲得粘膜層后，再使用機(jī)械剪碎法制備成單細(xì)胞懸液并用濾網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞；另外部分標(biāo)本采用棉簽直接刮取正常人群的口腔黏膜上皮細(xì)胞，并用濾網(wǎng)過(guò)濾之。然后用流式DNA直方圖來(lái)驗(yàn)證獲得的單細(xì)胞的各周期比例，進(jìn)一步采用

2、Ki67/DNA雙參數(shù)法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力。對(duì)照組是單用機(jī)械剪碎法和單用酶消化法以及人類(lèi)外周血淋巴細(xì)胞。
　　 結(jié)果：我們發(fā)現(xiàn)0.05-0.1％的胃蛋白酶濃度和1.2-2.4 u/ml的Dispase濃度能夠較好的去除胃、腸、口腔粘液而獲得粘膜層，然后剪碎并吹打，制備成胃、腸、口腔粘膜上皮細(xì)胞的單細(xì)胞懸液；用棉簽刮取的口腔黏膜上皮組織濾過(guò)之后直接成為單細(xì)胞懸液，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)較完整，細(xì)胞數(shù)量大于1×106，細(xì)胞存活率大

3、于90％，從而都能夠采用流式技術(shù)進(jìn)行單細(xì)胞分析。流式DNA含量法檢測(cè)胃、腸、口腔黏膜上皮細(xì)胞G1期約占80％～82％，S期約占11％～12％，Ki67/DNA雙參數(shù)法檢測(cè)胃、腸、口腔黏膜上皮組織的增殖率分別為11.67％、27.79％、23.48％，均低于體外培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞。
　　 結(jié)論：利用胃蛋白酶和Dispase能夠去除胃、腸、口腔粘液，較容易獲得高質(zhì)量的胃、腸、口腔粘膜上皮細(xì)胞的單細(xì)胞懸液，樣本完全適合FCM分析，結(jié)果滿(mǎn)意

4、。胃、腸、口腔粘膜上皮細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞分裂周期，適合成為人類(lèi)在體細(xì)胞的細(xì)胞增殖周期研究模型。
　　
　　 第二部分
　　 目的：以胃、腸和口腔黏膜上皮細(xì)胞為研究對(duì)象，研究人類(lèi)正常在體細(xì)胞的細(xì)胞周期核心調(diào)控因子的表達(dá)情況。
　　 方法：采用Western blot分析各種細(xì)胞周期調(diào)控因子Cyclins（A，B1，D1，E），CDKs（CDK1，2，4，6）、CKIs（P27，P21，P19，P16）和R

5、b的表達(dá)；并與正常人外周血淋巴細(xì)胞（PBL）和體內(nèi)骨髓單個(gè)核細(xì)胞（MNC）作為對(duì)比分析。
　　 結(jié)果：Western blot分析結(jié)果顯示：口腔黏膜上皮細(xì)胞（OME）中cyclin D1明顯表達(dá)，cyclin A、cyclin B1和cyclin E無(wú)表達(dá)或微弱表達(dá)；胃、腸黏膜上皮細(xì)胞（GME和IME）中cyclin A、cyclin B1、cyclin D3和cyclin E均無(wú)表達(dá)或微弱表達(dá)。口腔黏膜上皮細(xì)胞中CDK2、CD

6、K4和CDK6明顯表達(dá)，而CDK1無(wú)表達(dá)或微弱表達(dá)；胃腸黏膜上皮細(xì)胞中CDK2明顯表達(dá)，并且胃黏膜上皮細(xì)胞中CDK2的表達(dá)比腸黏膜上皮細(xì)胞的表達(dá)要低，而CDK1、CDK4和CDK6無(wú)表達(dá)或微弱表達(dá)?？谇火つど掀ぜ?xì)胞中p19、p21和p27明顯表達(dá)，而p16無(wú)表達(dá)或微弱表達(dá)；胃腸黏膜上皮細(xì)胞中p19明顯表達(dá)，而p16、p21和p27無(wú)表達(dá)或微弱表達(dá)。胃、腸、口腔黏膜上皮細(xì)胞中Rb無(wú)表達(dá)或微弱表達(dá)。
　　 結(jié)論：細(xì)胞周期調(diào)控因子體內(nèi)

7、細(xì)胞與體外培養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)以及體內(nèi)細(xì)胞與細(xì)胞之間的表達(dá)并不完成相同，提示人類(lèi)在體細(xì)胞周期核心機(jī)制可能存在多樣性。
　　
　　 第三部分
　　 目的：探討人類(lèi)在體細(xì)胞（胃、腸、口腔黏膜上皮細(xì)胞）的細(xì)胞周期核心調(diào)控機(jī)制，即Cyclins時(shí)相性起伏及CDKs序列激活規(guī)律。
　　 方法：Cyclins時(shí)相性表達(dá)規(guī)律：Post-sorting Western blot（分選后蛋白電泳技術(shù)）檢測(cè)四種Cyclins在細(xì)

8、胞周期不同時(shí)相中的表達(dá)。CDKs序列激活規(guī)律：Post-sorting Western blot（分選后免疫共沉淀技術(shù)）分析Cyclins和CDKs的相互結(jié)合規(guī)律。陽(yáng)性對(duì)照采用正常人外周血PHA刺激培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞（PBL）和體內(nèi)骨髓單個(gè)核細(xì)胞（MNC）。
　　 結(jié)果：Cyclins時(shí)相性表達(dá)規(guī)律：體內(nèi)OME的表達(dá)規(guī)律是：Cyclin D1在G1早期合成，S期和G2/M期開(kāi)始下降；Cyclin E、Cyclin A和 Cyclin

9、 B1無(wú)表達(dá)或在G1期有微弱表達(dá)。體內(nèi)GME和IME的表達(dá)規(guī)律是：Cyclin D1、Cyclin E、Cyclin A和 Cyclin B1無(wú)表達(dá)或在G1期有微弱表達(dá)。CDKs序列激活規(guī)律：在OME中，在G1、S、G2/M期，Cyclin D1均與CDK2、CDK4、CDK6結(jié)合；在G1期，cyclin D1/CDK4/CDK6結(jié)合最多；在G2/M期，cyclin D1/CDK2結(jié)合最多。在GME和IME中，在G1、S、G2/M期，C