揚(yáng)州市結(jié)核分枝桿菌分子分型及耐藥性監(jiān)測(cè).pdf

1、結(jié)核病(Tuberculosis，TB)是由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacterium tuberculosiscomplex，MTBC)引起的一種慢性傳染病，主要感染人的呼吸道系統(tǒng)。據(jù)WHO估計(jì)，世界上近三分之一的人口已感染結(jié)核分枝桿菌。雖然TB流行水平呈下降趨勢(shì)，但每年新發(fā)病例仍突破900萬(wàn)例，并且，隨著耐藥菌株的不斷出現(xiàn)，對(duì)結(jié)核病的治療和防控造成很大的挑戰(zhàn)。因此，結(jié)核分枝桿菌菌種的鑒定分型以及耐藥性監(jiān)測(cè)對(duì)于該病的診斷、治療以及

2、預(yù)后都有著重要的意義。本研究針對(duì)結(jié)核分枝桿菌揚(yáng)州臨床分離株，運(yùn)用傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)方法和多位點(diǎn)PCR相結(jié)合，初步鑒定分枝桿菌的種屬，再利用MIRU-VNTR和Spoligotyping分型方法研究其流行病學(xué)特征，最后通過(guò)比例法、MIC和耐藥基因檢測(cè)分析結(jié)核分枝桿菌耐藥性情況。
　　1揚(yáng)州市結(jié)核分枝桿菌的分離培養(yǎng)與鑒定
　　用抗酸染色實(shí)驗(yàn)確定抗酸桿菌陽(yáng)性后，用PNB/TCH試驗(yàn)和多位點(diǎn)PCR從抗酸桿菌陽(yáng)性菌株中鑒定出結(jié)核分枝桿菌（My

3、cobacterium tuberculosis, MTB），并比較兩個(gè)方法之間的差異。結(jié)果顯示，289株抗酸染色陽(yáng)性臨床分離株，經(jīng)過(guò)PNB/TCH試驗(yàn)和多位點(diǎn)PCR進(jìn)一步鑒定，其中270株為MTB，9株為非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)，2株為M.africanum，剩余8株需進(jìn)一步鑒定。PNB/TCH試驗(yàn)結(jié)果與多位點(diǎn)PCR結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。鑒定結(jié)果表明，揚(yáng)州市結(jié)核病例絕大多數(shù)是由

4、結(jié)核分枝桿菌所引起的，但也存在非結(jié)核分枝桿菌引起的結(jié)核病。
　　2結(jié)核分枝桿菌揚(yáng)州分離株的分子分型研究
　　CTAB法提取到270株MTB分離株基因組DNA，用MIRU-VNTR和Spoligotyping進(jìn)行基因分型。Spoligotyping方法共區(qū)分出8個(gè)家族，其中北京家族233株、T1家族15株、未知家族菌株11株、相似北京家族4株、U家族3株、H3家族2株、MANU2家族1株、T2家族1株。MIRU-VNTR方法共

5、區(qū)分出154個(gè)基因型，其中144株組成28個(gè)簇，剩余126株均為獨(dú)立基因型，該方法的分辨力為0.960。在15個(gè)VNTR位點(diǎn)中，不管是對(duì)全部菌株還是只對(duì)北京家族進(jìn)行分析，Mtub21位點(diǎn)的HGDI值均為最高，分別為0.545和0.451。MIRU-VNTR分型方法的分辨率(0.960)明顯高于Spoligotyping方法的分辨力(0.253)，且兩種分型方法相結(jié)合會(huì)使分辨力更高。通過(guò)分型研究，我們發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌揚(yáng)州分離株具有一定的基

6、因多態(tài)性，北京家族基因型菌株為該市的主要流行菌株，其流行趨勢(shì)具有高度集中性，同時(shí)Spoligotyping方法也發(fā)現(xiàn)了11個(gè)新基因型，豐富了SpolDB4數(shù)據(jù)庫(kù)。
　　3結(jié)核分枝桿菌揚(yáng)州分離株的耐藥表型及耐藥基因分析
　　通過(guò)傳統(tǒng)比例法和MIC方法對(duì)174株臨床表現(xiàn)為耐藥的分離株進(jìn)行耐藥性檢測(cè)，并針對(duì)鑒定為耐藥的菌株進(jìn)行耐藥基因的測(cè)序（主要針對(duì)四種一線藥:異煙肼INH、利福平RFP、鏈霉素SM、乙胺丁醇EMB）。傳統(tǒng)比例法耐

7、藥性結(jié)果顯示174株MTB中有72株耐藥(41.4％)，多重耐藥菌株有32株(18.4％)。對(duì)72株耐藥菌株的耐藥性檢測(cè)方面，MIC法與傳統(tǒng)比例法的結(jié)果之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。耐藥基因比對(duì)結(jié)果顯示，INH耐藥菌株中，katG突變率為72.0％(36/50)，inhA突變率為6.0％(3/50);RFP耐藥菌株中，rpoB突變率為67.5％(27/40);EMB耐藥菌株中，embB突變率為52.6％(10/19);SM耐藥菌株中，rrs突

8、變率為15.4％(6/39)，rpsL突變率為71.8％(28/39)。通過(guò)比對(duì)分析，耐藥基因的突變與結(jié)核分枝桿菌耐藥表型密切相關(guān)，出現(xiàn)耐藥表型的菌株不一定發(fā)生耐藥基因突變，但是耐藥基因突變的菌株全部耐藥。
　　本研究以揚(yáng)州市2012-2015年結(jié)核分枝桿菌為對(duì)象，通過(guò)分離鑒定、分子分型、藥物敏感性試驗(yàn)和耐藥基因突變位點(diǎn)分析等檢測(cè)，在分子水平分析揚(yáng)州地區(qū)結(jié)核分枝桿菌的分布和傳播特征，為該地區(qū)結(jié)核病的防治策略的訂制提供科學(xué)參考依據(jù)，