結(jié)核分枝桿菌基因分型及異煙肼新耐藥突變位點(diǎn)的確認(rèn)研究.pdf

1、目的：
　　 為了有效控制和預(yù)防結(jié)核病的流行和傳播，除了全面實(shí)施結(jié)核病控制專項(xiàng)外，我們還需要建立健全流行病學(xué)監(jiān)測體系，加強(qiáng)對結(jié)核分枝桿菌耐藥機(jī)制和耐藥結(jié)核病監(jiān)測的研究。為此，我們對近幾年福州地區(qū)分離的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進(jìn)行分子流行病學(xué)研究，以期了解本地區(qū)流行菌株的主要基因型及其分布情況，并評價(jià)基因分型的效果；從體內(nèi)和體外兩個(gè)層面對突變位點(diǎn)與耐藥的關(guān)系進(jìn)行研究，以闡明katG基因新的突變引起異煙肼耐藥的機(jī)制；利用反向分子雜交方

2、法檢測基因突變位點(diǎn)，為建立耐藥基因快速檢測方法奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.運(yùn)用Spoligotyping方法對福州地區(qū)結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進(jìn)行基因分型，并與國際數(shù)據(jù)庫SpolDB4進(jìn)行比較；同時(shí)對本地區(qū)北京基因型與非北京基因型在年齡、性別、耐藥株的分布情況進(jìn)行比較分析；
　　 2.運(yùn)用MLVA-15方法對上述分離株進(jìn)行基因分型，通過生物信息學(xué)軟件(Bionumerics5.0)對各基因型進(jìn)行聚類分析，比

3、較不同組別患者結(jié)核分枝桿菌成簇率的差別，探討結(jié)核分枝桿菌易于傳播的人群特征；
　　 3.用HGDI指數(shù)比較兩種基因分型方法的效率；
　　 4.選取菌株FJ05122(含新突變位點(diǎn)Asn329Val)、FJ05005(含常見突變位點(diǎn)Ser315Thr)和H37Rv(含野生型katG基因)分別作為實(shí)驗(yàn)株、對照株和標(biāo)準(zhǔn)株，構(gòu)建單獨(dú)含上述突變位點(diǎn)和Arg463Leu位點(diǎn)、上述位點(diǎn)與Arg463Leu聯(lián)合突變位點(diǎn)、野生型katG基

4、因的重組表達(dá)克隆和重組穿梭載體克??；
　　 5.以pProEx HTb質(zhì)粒構(gòu)建的各重組克隆表達(dá)重組KatG蛋白，純化后進(jìn)行酶活性雙重染色以及過氧化氫酶、過氧化物酶活性測定，比較不同重組KatG蛋白酶活性的差異；
　　 6.以pMV361質(zhì)粒構(gòu)建的各重組穿梭載體克隆電轉(zhuǎn)化恥垢分枝桿菌INH低耐藥株和高耐藥株，比較基因?qū)肭昂筠D(zhuǎn)化菌INH最小抑菌濃度MIC的改變；
　　 7.對福州地區(qū)結(jié)核分枝桿菌臨床分離株rpoB、

5、katG基因熱點(diǎn)突變區(qū)進(jìn)行測序，了解福州地區(qū)耐藥基因突變的特點(diǎn)；
　　 8.設(shè)計(jì)反向分子雜交探針，用于檢測耐藥菌株的基因突變位點(diǎn)，并與測序結(jié)果相比較，評價(jià)該檢測方法的敏感性和特異性。
　　 結(jié)果：
　　 1.245株菌中，有223株為已知的spoligotype，22株(21種)為SpolDB4未曾記錄的新基因型；福州地區(qū)流行的結(jié)核分枝桿菌基因型主要為北京基因家族、H3基因家族、T1基因家族，分別占53.06％(

6、130/245)、14.69％(36/245)、9.80％(24/245)。
　　 2.Spoligotyping分型將245株結(jié)核分枝桿菌分為70種基因型，其中成簇基因型16個(gè)，獨(dú)特基因型54個(gè)，分辨率76.78％，菌株成簇率77.96％；最大一簇菌為北京基因型，北京基因型與非北京基因型在年齡、性別、耐藥株的分布均沒有顯著性差異。
　　 3.MLVA分型將245株結(jié)核分枝桿菌分為163種基因型，其中成簇基因型27個(gè)，獨(dú)

7、特基因型136個(gè)，分辨率98.28％，菌株成簇率44.49％；MLVA各位點(diǎn)多態(tài)性在0.040～0.661之間，其中ETR-E、MIRU26、MIRU10位點(diǎn)的多態(tài)性較好(h＞0.58)， MIRU23位點(diǎn)的多態(tài)性較差(h＜0.10)。
　　 4.兩種方法聯(lián)合使用時(shí)，116株北京基因型菌通過MLVA可以進(jìn)一步分成65個(gè)基因型(14簇和51個(gè)獨(dú)特基因型)，成簇基因型減少為24個(gè)，獨(dú)特基因型增加為182個(gè)，分辨率至98.65％，菌株

8、成簇率35.51％。
　　 5.與重組野生型KatG比較，Asn329Val突變可引起含該突變位點(diǎn)的重組KatG過氧化氫酶活性喪失，過氧化物酶活性降低約30％；Ser315Thr突變導(dǎo)致重組KatG過氧化氫酶活性下降約60％，過氧化物酶活性降低約30％。
　　 6.含Asn329Val、Ser315Thr突變的katG基因進(jìn)入恥垢分枝桿菌后，轉(zhuǎn)化菌的MIC較母本株增高，增加INH耐藥性；而野生型katG基因則使轉(zhuǎn)化菌的M

9、IC較母本株降低，增加對INH敏感性。這種效果在INH低耐藥株和高耐藥株表現(xiàn)一致。
　　 7.福州地區(qū)耐藥菌株中，rpoB基因突變主要發(fā)生在Ser531、His526、Asp516，發(fā)生率分別為51.72％、17.24％、8.05％；katG基因突變類型主要為Ser315Thr，發(fā)生率為46.91％。
　　 8.利用反向雜交方法檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥突變位點(diǎn)，在97株分離株(包含79株耐多藥菌株和18株全敏感株)檢測中，與

10、測序結(jié)果比較，rpoB基因突變檢測的敏感性、特異性和一致性分別為87.69％、96.88％、90.22％：katGS315T突變檢測的敏感性、特異性和一致性分別為94.44％、90.16％、91.75％
　　 結(jié)論：
　　 1.北京基因型是福州地區(qū)結(jié)核分枝桿菌主要的流行基因型，占53.06％；北京基因型與非北京基因型在年齡、性別、耐藥株分布情況均沒有顯著性差異；檢測出21種spolDB4未有記錄的新的Spoligotyp

11、es；
　　 2.Spoligotyping和MLVA是簡便可行的基因分型方法，可以用于流行病學(xué)監(jiān)測。Spoligotyping的效率低于MLYA，但Spoligotyping方法易于鑒別北京基因型；兩種方法聯(lián)合應(yīng)用，可以提高基因分型的分辨率。
　　 3.MLVA位點(diǎn)多態(tài)性差別較大，可以剔除多態(tài)性低的位點(diǎn)，增加多態(tài)性高的位點(diǎn)，以提高M(jìn)LVA的分辨率。
　　 4.katG基因Asn329Val突變，其重組蛋白過氧化