結(jié)核分枝桿菌Rv3717基因的克隆、表達(dá)及功能鑒定.pdf

1、結(jié)核分枝桿菌是全球主要的病原體之一，隨著多重耐藥菌株的增加，其威脅性也隨之增大。結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞壁相對(duì)較厚、硬并且具有疏水性，能夠有效地保護(hù)細(xì)菌，因此抗菌藥物的開(kāi)發(fā)具有較高的難度。
　　 乙胺丁醇(Ethambutol，EMB)，是一種一線抗結(jié)核的藥物。本課題利用生物信息學(xué)的方法，發(fā)現(xiàn)一種未知功能的基因Rv3717。當(dāng)乙胺丁醇作用于結(jié)核分枝桿菌后，Rv3717基因的表達(dá)上調(diào)。該基因被預(yù)測(cè)具有水解肽聚糖的功能，可能會(huì)造成肽聚糖的

2、水解，引起細(xì)胞的自溶。
　　 肽聚糖是結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁核心結(jié)構(gòu)的重要組成部分，目前關(guān)于分枝桿菌細(xì)胞壁自溶素(也稱為肽聚糖水解酶)的了解并不多。已知枯草芽孢桿菌的cwlB基因是一種已知的細(xì)胞壁自溶素，把此基因的序列與結(jié)核分枝桿菌的基因組序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，找到兩種同源基因Rv3915和Rv3717，推測(cè)該兩種基因表達(dá)的蛋白質(zhì)可能同樣具有肽聚糖水解酶的活性。有研究表明，Rv3915基因被成功克隆表達(dá)并且經(jīng)鑒定具有肽聚糖水解酶的

3、活性。因此，Rv3717基因是否也有此活性是本課題所要解決的問(wèn)題。
　　 對(duì)Rv3717基因肽聚糖水解酶活性的確定，有利于揭示EMB抗結(jié)核的作用機(jī)制，并為發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點(diǎn)進(jìn)而開(kāi)發(fā)新一代抗結(jié)核藥物提供理論依據(jù)。
　　 目的：通過(guò)對(duì)Rv3717目的基因的克隆表達(dá)，純化目的蛋白，以對(duì)Rv3717基因的功能進(jìn)行鑒定。
　　 方法：以結(jié)核分枝桿菌基因組DNA為模板，利用PCR技術(shù)進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增。使用克隆載體pMD18-

4、T與目的基因以“A-T連接方式構(gòu)建克隆質(zhì)粒pMD18-Rv3717;被擴(kuò)增的目的片段經(jīng)測(cè)序正確后，載體和目的片段分別經(jīng)雙酶切后進(jìn)行連接，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒。利用不同的載體和不同的宿主菌，通過(guò)調(diào)節(jié)誘導(dǎo)劑的濃度和誘導(dǎo)溫度等進(jìn)行目的蛋白的優(yōu)化表達(dá)。利用SDS-PAGE和Western blotting檢測(cè)目的基因的表達(dá)，利用Ni2+親和層析柱對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化并用酶譜法對(duì)目的蛋白進(jìn)行功能的檢測(cè)。
　　 結(jié)果：構(gòu)建了克隆質(zhì)粒pMD18-Rv3

5、717;擴(kuò)增的目的基因經(jīng)測(cè)序正確后，構(gòu)建了無(wú)突變堿基的表達(dá)質(zhì)粒pET29b-Rv3717和pET16b-Rv3717。表達(dá)質(zhì)粒pET29b-Rv3717在所使用的各種宿主菌中的蛋白表達(dá)量極低。表達(dá)質(zhì)粒pET16b-Rv3717在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達(dá)量高，但是絕大部分是以包涵體的形式存在，上清液中的可溶性目的蛋白比較少。目的蛋白的上清液經(jīng)鎳柱純化以后，得到含有少量雜蛋白的目的蛋白的純化物。純化的目的蛋白沒(méi)有檢測(cè)到肽聚糖水解酶