滲透壓對(duì)人氣道上皮細(xì)胞黏蛋白5AC分泌的調(diào)控研究.pdf

1、目的:
　　 氣道黏液高分泌是慢性氣道炎癥性疾病包括慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘和肺囊性纖維化等疾病的一個(gè)重要病理特征。人支氣管上皮細(xì)胞黏液增多是炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的結(jié)果,水、無(wú)機(jī)鹽離子和黏蛋白(mucin,MUC)等大分子構(gòu)成氣道黏液層,黏液潴留可導(dǎo)致病變氣道阻塞加重,并為氣道定植細(xì)菌提供良好的培養(yǎng)基,同時(shí)可釋放多種促分泌因子加劇黏液潴留過(guò)程[1,2,3],從而加快疾病的進(jìn)程并使病情惡化。理論上黏液層物理和化學(xué)性質(zhì)的任何改變都會(huì)影響

2、黏液性狀和分泌量,己知MUC5AC是氣道主要分泌型MUC,是超負(fù)荷生成病理性黏液中的主要成分,作為炎癥氣道黏蛋白的主要特征性表型,決定著高分泌黏液的病理特征[4,5]。目前對(duì)MUC5AC基因表達(dá)和分泌的相關(guān)分子機(jī)制已廣泛開(kāi)展,已知體內(nèi)多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞外因素如白介素(interleukin,IL)-4[6]、IL-13[7]、IL-9[8]、IL-6[9]、IL-1β、腫瘤壞死因子(tumornecrosis factor,TNF-α)

3、[10]、中性粒細(xì)胞彈力酶(neutrophil elastase,NE)[11]、表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,.EGFR.)配體[12]、空氣污染物[13]、細(xì)菌產(chǎn)物[14]、類(lèi)花生酸類(lèi)、自由基[15]和氧化應(yīng)激[16]等刺激均可以導(dǎo)致MUC5AC的異常,但是對(duì)臨床上常見(jiàn)的高滲鹽水可誘導(dǎo)排痰的分子機(jī)制卻并不清楚,滲透壓改變的條件下對(duì)MUC5AC分泌的效應(yīng)尚無(wú)報(bào)道。既往研究發(fā)現(xiàn)氣道

4、上皮細(xì)胞黏液出胞過(guò)程中黏液分泌顆粒復(fù)合物形成必需熱休克蛋白(heat shock proteins,HSP)70參與[17],HSP70可在多種刺激下誘導(dǎo)表達(dá)以保護(hù)氣道細(xì)胞,并與蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)有關(guān)[18],滲透壓反應(yīng)增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(osmoticresponse element binding protein,OREBP/nuclear factor Of activated Tcells,NFA

5、T5/toncity-responsive binding-protein,TonEBP)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)唯一已知滲透壓相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子,可調(diào)控HSP70等的表達(dá),保護(hù)細(xì)胞免受高滲應(yīng)激[19]。本研究選用體外培養(yǎng)人支氣道上皮細(xì)胞株HBE16的方法,以常見(jiàn)的高滲鹽水作為干預(yù)因素,探討滲透壓刺激對(duì)MUC5AC分泌的效應(yīng),以及HSP70、PKC和OREBP在黏液分泌中的機(jī)制,研究高滲下OREBP對(duì)HSP70的調(diào)控作用及其對(duì)MLIC5AC分泌的影響

6、,從而深入闡明高滲在氣道慢性炎癥性疾病黏液分泌中的可能機(jī)制,并為能從基因和分子水平解釋有效的臨床防治措施提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 細(xì)胞培養(yǎng)和高滲處理:體外培養(yǎng)正常人氣道上皮HBE16細(xì)胞株,加入10％高滲氯化鈉配成不同濃度的高滲培養(yǎng)基,滲透壓計(jì)檢測(cè)滲透壓。高滲培養(yǎng)前用無(wú)激素和無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。四甲基偶氮唑鹽光吸收法(methyl thiazolyl tetrazoliam,MTT法)檢測(cè)細(xì)胞活性。PKC各亞型抑

7、制劑和OREBP siRNA做為干擾因素處理高滲培養(yǎng)HBE16細(xì)胞。
　　 蛋白表達(dá)和轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè):采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linkedimmunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)培養(yǎng)上清中MUC5AC蛋白含量作為評(píng)價(jià)黏液分泌量的指標(biāo);Western Blot檢測(cè)HSP70-2和OREBP蛋白表達(dá),RT-PCR方法半定量檢測(cè)HSP70-2轉(zhuǎn)錄水平。細(xì)胞免疫化學(xué)和激光共聚焦技術(shù)觀察細(xì)胞在高滲下HSP70-2

8、和OREBP蛋白表達(dá)的變化。
　　 HSP70-2基因上游不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子序列熒光素酶(luciferase,Luc)報(bào)告基因質(zhì)粒載體的設(shè)計(jì)和構(gòu)建:從HBE16細(xì)胞中抽提人基因組DNA序列為模板,根據(jù)HSP70-2基因啟動(dòng)子上游調(diào)控區(qū)的基因序列及質(zhì)粒表達(dá)載體pGL3-Basic的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及實(shí)驗(yàn)需要設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物,PCR擴(kuò)增HSP70-2基因啟動(dòng)子上游5’端不同片斷,經(jīng)酶切和DNA測(cè)序鑒定證實(shí)HSP70-2基因啟動(dòng)子上游序列系列截短的

9、熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　 含人HSP70-2基因啟動(dòng)子滲透壓反應(yīng)增強(qiáng)子(osmotic responseelement,ORE)位點(diǎn)定點(diǎn)突變序列熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒載體的設(shè)計(jì)和構(gòu)建:基因啟動(dòng)子軟件分析提示HSP70-2基因啟動(dòng)子上游存在兩個(gè)潛在的ORE,ORE1位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)-1975位,ORE2位于-93位。ORE的共有序列為:TGGAANNNYNY(Y為T(mén)或C,N為任一堿基)。設(shè)計(jì)并導(dǎo)入定點(diǎn)突變引物使HSP7

10、0-2啟動(dòng)子上游的兩個(gè)ORE位點(diǎn)分別單獨(dú)失活。含人HSP70-2基因上游ORE位點(diǎn)定點(diǎn)突變序列熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒經(jīng)酶切和DNA測(cè)序鑒定證實(shí)構(gòu)建成功。
　　 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和熒光素酶活性測(cè)定:報(bào)告基因質(zhì)粒和OREBP siRNA通過(guò)脂質(zhì)體2000共轉(zhuǎn)染HBE16細(xì)胞,連續(xù)培養(yǎng)24h和48h后加高滲處理,12小時(shí)孵育后收集細(xì)胞,采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)計(jì)算報(bào)告基因的相對(duì)表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:
　　 1、高滲能有效

11、刺激HBE16細(xì)胞培養(yǎng)上清MUC5AC蛋白分泌量增加,與對(duì)照組相比較差異顯著,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且結(jié)果顯示在所選實(shí)驗(yàn)濃度范內(nèi)(500和600mOsm/kgH2O)MUC5AC隨培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)濃度的改變對(duì)高滲鹽水刺激有時(shí)間和劑量依賴關(guān)系(p＜0.05)。當(dāng)滲透濃度增加到1000mOsm/kgH2O時(shí)HBEl6細(xì)胞存活率降低,與對(duì)照組相比,差異有顯著性(p＜0.05)。
　　 2、高滲培養(yǎng)后,OREBP和HSP70-2蛋白在細(xì)胞內(nèi)的熒光

12、表達(dá)顯著增加,HSP70-2蛋白和轉(zhuǎn)錄水平較對(duì)照組顯著升高,并隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加(p＜0.05),同時(shí)OREBP蛋白表達(dá)增加,且隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增)加(p＜0.01)。
　　 3、用PKCμ抑制劑G(o)6976處理高滲培養(yǎng)下HBE16細(xì)胞,培養(yǎng)上清MUC5AC蛋白含量、HSP70-2蛋白和轉(zhuǎn)錄水平較高滲組顯著降低(p＜0.01),但仍高于對(duì)照組(p＜0.05);而PKCα抑制劑Safingol,PKCβ抑制劑LY

13、333531和PKCδ抑制劑Rottlerin處理細(xì)胞后,上述指標(biāo)水平無(wú)顯著改變。
　　 4、siRNA抑制OREBP表達(dá)后,高滲刺激下的OREBP、HSP70-2和上清MUC5AC蛋白相對(duì)含量顯著減少(p均＜0.05)。
　　 5、成功構(gòu)建系列截短的HSP70-2啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒,真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)與OREBP siRNA共轉(zhuǎn)染導(dǎo)入HBE16細(xì)胞,觀察高滲刺激下的細(xì)胞,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染分別含2、1、1個(gè)ORE位點(diǎn)的

14、pGL3-HSP70-2(-2181/+165)-Luc、pGL3-HSP70-2(-1394/+165)-Luc和pGL3-HSP70-2(-353/+165)-Luc細(xì)胞后在高滲刺激下的熒光素酶比活性無(wú)明顯改變(p＞0.05);而轉(zhuǎn)染HSP70-2啟動(dòng)子不含ORE位點(diǎn)的pGL3-HSP70-2(-66/+165)-Luc細(xì)胞在高滲刺激下的熒光素酶比活性與高滲組的細(xì)胞相比顯著降低(p＜0.01)。
　　 6、構(gòu)建突變-1975

15、位點(diǎn)的OREl和位于-93位點(diǎn)的ORE2的HSP70-2啟動(dòng)子報(bào)告基因載體,與OREBP siRNA共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后檢測(cè),突變ORE1后細(xì)胞在高滲刺激下的熒光素酶表達(dá)與高滲組相比無(wú)顯著改變(p＞0.05);突變ORE2后高滲刺激下的熒光素酶比活性與高滲組比較顯著降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1、高滲刺激可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的HBE16細(xì)胞MUC5AC分泌,在所選實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)時(shí)間和濃度依賴關(guān)系,但同時(shí)

16、高滲對(duì)HBE16細(xì)胞活力的影響也逐步加大,隨滲透時(shí)間延長(zhǎng)和滲透濃度加大細(xì)胞存活率下降。
　　 2、高滲培養(yǎng)后,OREBP和HSP70-2蛋白在細(xì)胞內(nèi)的熒光表達(dá)顯著增加,HSP70-2蛋白和轉(zhuǎn)錄水平,OREBP蛋白水平均顯著增加,提示HSP70-2和OREBP參與高滲致HBE16細(xì)胞MUC5AC分泌過(guò)程。用PKCμ抑制劑處理高滲培養(yǎng)下細(xì)胞,HSP70-2蛋白、轉(zhuǎn)錄水平和MUC5AC分泌較高滲組顯著減少,但仍高于對(duì)照組;而用PKCα

17、抑制劑、PKCβ抑制劑和PKCδ抑制劑處理后HSP70-2蛋白、轉(zhuǎn)錄水平和MUC5AC分泌均無(wú)改變,考慮高滲致黏液分泌可能是部分通過(guò)PKCμ-HtSP70-2依賴的信號(hào)通路。siRNA抑制OREBP表達(dá)后,高滲刺激下的OREBP、HSP70-2和上清MUC5AC蛋白相對(duì)含量顯著減少,進(jìn)一步證實(shí)OREBP和HSP70-2參與高滲下黏液分泌的過(guò)程。
　　 3、成功構(gòu)建系列截短的HSP70-2上游啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒和含兩個(gè)OR

18、E位點(diǎn)突變的HSP70-2啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒,為今后深入開(kāi)展高滲對(duì)黏液分泌的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　 4、高滲刺激可分別誘導(dǎo)HSP70-2啟動(dòng)子含2、1、1個(gè)ORE位點(diǎn)的pGL3-HSP70-2(-2181/+165)-Luc、pGL3-HSP70-2(-1394/-H65)-Luc和pGL3-HSP70-2(-353/+165)-Luc序列的報(bào)告基因質(zhì)粒仍然表達(dá)熒光素酶,而不含ORE位點(diǎn)的pGL3-HSP70-2(-6

19、6/-H65)-Luc序列的報(bào)告基因質(zhì)粒對(duì)高滲刺激無(wú)反應(yīng),不表達(dá)熒光素酶,說(shuō)明在HSP70-2啟動(dòng)子上游-66到-353序列之間存在ORE關(guān)鍵位點(diǎn)。
　　 5、高滲刺激可誘導(dǎo)HSP70-2啟動(dòng)子-1975位點(diǎn)的ORE1發(fā)生定點(diǎn)突變序列的報(bào)告基因質(zhì)粒表達(dá)熒光素酶,而含有-93位點(diǎn)的ORE2發(fā)生定點(diǎn)突變序列的報(bào)告基因質(zhì)粒對(duì)高滲刺激無(wú)明顯反映,提示高滲鹽水誘導(dǎo)OREBP通過(guò)與HSP70-2啟動(dòng)子上-93位點(diǎn)的ORE結(jié)合而激活HSP70