木材煙霧凝集物刺激人氣道上皮細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化樣改變.pdf

1、研究背景：
　　氣道重塑是慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)的主要病理特征和引起不可逆性氣流受限的主要原因之一,其中,上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)在氣道重構(gòu)中發(fā)揮作用。氣道上皮細(xì)胞可能經(jīng)由EMT獲得成纖維細(xì)胞樣表型,促進(jìn)氣道重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展。越來(lái)越多研究指出,慢阻肺發(fā)病可能與生物燃料(biomass

2、 fuels,BMF)煙霧暴露有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn),暴露于BMF者肺組織出現(xiàn)纖維化樣改變,最近研究發(fā)現(xiàn),煙草煙霧凝集物能誘導(dǎo)人氣道上皮細(xì)胞發(fā)生類似EMT的改變。由此推斷,BMF可能通過(guò)EMT樣的過(guò)程引起肺纖維化,從而參與氣道重塑。但是,有關(guān)生物燃料煙霧在氣道重塑發(fā)生過(guò)程中的機(jī)制尚不甚明了。
　　研究目的：
　　本研究觀察木材煙霧凝集物(wood smoke condense,WSC)對(duì)人氣道上皮細(xì)胞(16HBE)的損害作用及其對(duì)

3、EMT相關(guān)標(biāo)志物及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP9)表達(dá)的影響,為生物燃料煙霧暴露致慢阻肺的機(jī)制提供線索。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　一、WSC制備:置適量杉木鋸末于250ml錐形瓶?jī)?nèi)以酒精燈引燃,將內(nèi)附玻璃纖維濾膜的過(guò)濾器兩邊連上膠管,一端置于瓶口收集煙霧,另一端接上60ml注射器,待煙霧出現(xiàn)開(kāi)始抽吸。抽吸完畢,卸下膜置于皿中,用DMSO溶解凝聚物,經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌后,離心,沉淀物用DMSO重懸,定量分裝備用。
　　

4、二、WSC細(xì)胞毒性檢測(cè):體外培養(yǎng)16HBE細(xì)胞,將細(xì)胞分成WSC刺激組、對(duì)照組(未給任何刺激物)和煙草煙霧凝聚物(cigarette smoke condense,CSC)刺激組,細(xì)胞融合達(dá)60％時(shí),分別以5個(gè)刺激濃度的WSC(5ug/ml、10ug/ml、20ug/ml、40ug/ml、50ug/ml)和CSC(5ug/ml、10ug/ml、20ug/ml、40ug/ml、50ug/ml)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。至培養(yǎng)第7天,用CCKit-8

5、檢測(cè)細(xì)胞總體活性。
　　三、EMT相關(guān)標(biāo)志物檢測(cè):體外培養(yǎng)16HBE細(xì)胞,將細(xì)胞分成WSC刺激組、CSC刺激組和對(duì)照組,待細(xì)胞融合達(dá)60%時(shí),分別以WSC(10μg/ml)、CSC(10μg/ml)進(jìn)行干預(yù),對(duì)照組不施加任何干預(yù)因素,7天后,于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),以Western-blot法檢測(cè)16HBE中E鈣粘蛋白(E-cad)和I型膠原(COLI)的表達(dá)水平;以細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)16HBE中E-cad、COL1和波

6、形蛋白(vimentin)的表達(dá)水平。
　　四、促EMT發(fā)生細(xì)胞因子基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)檢測(cè):細(xì)胞分組和培養(yǎng)同前。以WSC(10μg/ml)處理16HBE細(xì)胞7天后,以Western-blot和細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)16HBE中MMP9的表達(dá)水平。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　一、細(xì)胞毒性:CCK8檢測(cè)顯示,WSC和CSC組均在10ug/ml時(shí)OD值達(dá)最高,分別為2.358±0.072和2.562±0.045,P值均<0

7、.05。
　　二、細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察:WSC(10μg/ml)刺激16HBE細(xì)胞7天后,部分細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)出與CSC刺激相同的改變,由鵝卵石狀向長(zhǎng)梭形、多角形或星形改變。
　　三、EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)水平:Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,WSC刺激后,16HBE細(xì)胞E-cad蛋白的相對(duì)含量(目的蛋白與內(nèi)參條帶光密度的比值)為0.298±0.050,明顯低于對(duì)照組(0.585±0.078),p<0.05,與CSC刺激組(0.

8、295±0.052)沒(méi)有明顯差別,p>0.05;WSC刺激組COLI蛋白的相對(duì)含量為0.578±0.042,明顯高于對(duì)照組(0.263±0.022),p<0.05,但是和CSC刺激組(0.596±0.019)沒(méi)有明顯差異,p>0.05。細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,WSC刺激后,COL1和vimentin蛋白表達(dá)量較對(duì)照組增加,而E-cad蛋白的表達(dá)量減少;與CSC組比較差異不明顯。
　　四、MMP9表達(dá)水平:Western bl

9、ot檢測(cè)結(jié)果顯示,MMP9在WSC刺激組(0.558±0.077)和CSC刺激組(0.543±0.103)沒(méi)有明顯差別,p>0.05;但均高于對(duì)照組(0.193±0.031),p<0.05。細(xì)胞免疫熒光技術(shù)顯示,經(jīng)WSC刺激7天后,16HBE細(xì)胞中MMP9蛋白與對(duì)照組比較,表達(dá)量增加;而WSC組和CSC組無(wú)明顯區(qū)別。
　　結(jié)論：
　　1、木材煙霧凝集物刺激人氣道上皮細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)改變;
　　2、木材煙霧凝集物可引起人氣