肺炎支原體感染呼吸道上皮細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、背景和目的:
　　肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae, MP）是引起各年齡段呼吸道感染的重要病原體之一。MP感染一般呈自限性過程，預(yù)后良好，但近年來發(fā)現(xiàn)重癥與難治性MP肺炎呈上升趨勢，部分患兒甚至出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥，因此受到更加廣泛的關(guān)注。但MP感染的致病機制目前仍不完全明確，主要有呼吸道上皮細(xì)胞粘附、MP直接侵入和免疫學(xué)發(fā)病機制等學(xué)說。雖然MP粘附于呼吸道上皮細(xì)胞并與上皮細(xì)胞相互作用是MP發(fā)病早期中關(guān)鍵的一個環(huán)節(jié)

2、，但對呼吸道上皮細(xì)胞被MP感染后所發(fā)生的反應(yīng)知之甚少。目前已知呼吸道上皮細(xì)胞受MP刺激后具有釋放某些蛋白質(zhì)參與免疫炎癥反應(yīng)的能力，但迄今為止所有研究都僅基于對個別已知蛋白的分析測定，缺乏整體性，并且無法對未知蛋白質(zhì)進行分析。
　　基于上述背景，本研究擬從整體角度采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對MP感染后的呼吸道上皮細(xì)胞的分泌蛋白質(zhì)組進行分離鑒定，比較正常狀態(tài)與受MP感染后分泌蛋白圖譜的差異，通過生物信息學(xué)手段分析并在功能上驗證差異蛋白，尋找具

3、有生物學(xué)意義的上皮細(xì)胞分泌蛋白，為進一步闡明MP感染的發(fā)病機制提供重要的理論依據(jù);同時尋找特異蛋白作為MP感染診斷/治療的分子指標(biāo)/靶點，為臨床診斷/治療提供新的線索。
　　方法:
　　1.以MP感染人肺腺癌細(xì)胞（A549細(xì)胞）作為體外研究的模型系統(tǒng)，通過MTT比色法、臺盼藍染色、細(xì)胞凋亡檢測等方法確立合適的無血清培養(yǎng)條件。
　　2.利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)合DeCyder MS無標(biāo)記定量軟件，分析比較MP感染（處

4、理組）與非感染（對照組）情況下，A549細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)組的表達變化。
　　3.綜合GO數(shù)據(jù)庫、分泌蛋白預(yù)測軟件(SingalP、SecretomeP)和ExoCarta數(shù)據(jù)庫對鑒定的所有蛋白進行檢索分析，預(yù)測所有蛋白的細(xì)胞定位。
　　4.BiNGO軟件分析差異分泌蛋白的細(xì)胞組分、分子功能及其參與的生物學(xué)過程。
　　5.KEGG數(shù)據(jù)庫分析差異分泌蛋白涉及的生物學(xué)通路。
　　6.STRING軟件分析差異分泌蛋白之間的

5、相互作用。
　　7.挑取6個差異分泌蛋白(ADAM9、SERPNE1、IL-33、IGFBP4、Gal-1、MIF)，采用Western blot和RT-PCR對其表達水平進行檢測。
　　8.設(shè)計Gal-1的siRNA序列，采用Western blot對其干擾效果進行驗證，挑取干擾效率良好的siRNA進行進一步Gal-1的功能研究。Gal-1的功能研究分別采用流式細(xì)胞術(shù)檢測活性氧(ROS)水平，免疫熒光觀察γH2AX形成情況

6、，Westernblot檢測γH2AX表達情況，以及RT-PCR檢測細(xì)胞因子表達改變。
　　9.采用配對對照研究的方式，收集MP肺炎患兒和無合并感染的異物吸入患兒的外周血和肺泡灌洗液，應(yīng)用ELISA方法檢測其中IL-33的水平。
　　結(jié)果:
　　1.無血清培養(yǎng)24 h時，A549細(xì)胞存活率均在98.5％以上，其細(xì)胞形態(tài)、增殖速率和存活率與含血清培養(yǎng)均無明顯差異。
　　2.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)共鑒定256個非冗余

7、蛋白質(zhì)，其中對照組233個，處理組237個。經(jīng)DeCyder MS無標(biāo)記定量分析共發(fā)現(xiàn)表達差異超過1.5倍(p＜0.05)的蛋白質(zhì)有113個，其中65個在處理組表達上調(diào)，48個在處理組表達下調(diào)。
　　3.SingalP和SecretomeP軟件預(yù)測顯示，在鑒定的256個蛋白中，83個屬于經(jīng)典途徑分泌的蛋白，69個屬于非經(jīng)典途徑分泌蛋白。同時，ExoCarta數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，在鑒定的256個蛋白中，190個蛋白能通過外泌小體到達胞外

8、。GO數(shù)據(jù)庫資源檢索發(fā)現(xiàn)鑒定的256個蛋白中的大部分蛋白對應(yīng)一種以上的細(xì)胞成分分類注釋，可同時涉及細(xì)胞核、細(xì)胞膜、細(xì)胞胞漿等多種細(xì)胞組分。
　　4.BiNGO軟件分析顯示，細(xì)胞組分方面:113個差異分泌蛋白并不是來自某一特定的細(xì)胞器，而是來自多個不同的細(xì)胞器，比如線粒體、溶酶體等;分子功能方面:上調(diào)的65個蛋白主要與氧化還原活性、蛋白結(jié)合活性、酶調(diào)節(jié)功能有關(guān)，而下調(diào)的48個蛋白主要與酶活性抑制和水解酶活性有關(guān);生物學(xué)過程方面:上調(diào)

9、的蛋白主要涉及糖代謝、炎癥反應(yīng)、氧化還原和防御反應(yīng)這四個過程，而下調(diào)的蛋白主要涉及系統(tǒng)發(fā)育過程。
　　5.KEGG通路數(shù)據(jù)庫的檢索發(fā)現(xiàn)113個差異蛋白共涉及85條生物學(xué)通路，經(jīng)聚類分析發(fā)現(xiàn)其主要富集于丙酮酸代謝、糖酵解/糖原合成、病原體感染等11條通路。
　　6.STRING在線分析發(fā)現(xiàn)113個差異蛋白中，有88個蛋白可與其他蛋白存在相互作用。其中，上調(diào)的65個蛋白主要形成3個小的蛋白與蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，分別為應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)蛋

10、白網(wǎng)絡(luò)、信號通路相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞代謝相關(guān)網(wǎng)絡(luò);下調(diào)的48個蛋白，主要形成2個小的蛋白與蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，分別為糖代謝相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)和生物學(xué)過程負(fù)性調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)。
　　7.RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示ADAM9、SERPNE1、IL-33、IGFBP4、Gal-1、MIF這6個蛋白的表達水平與質(zhì)譜鑒定結(jié)果一致。
　　8.siRNA干擾Gal-1表達后，A549細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯降低、細(xì)胞核內(nèi)γH2AX焦

11、點形成明顯減少、γH2AX表達水平亦降低，同時細(xì)胞因子IL-8和IL-18在24 h時表達水平明顯升高。
　　9.IL-33在MP肺炎患兒的血清和肺泡灌洗液中的水平顯著高于無感染的支氣管異物患兒。
　　結(jié)論:
　　1.MP感染可引起A549細(xì)胞分泌蛋白表達的改變;運用非標(biāo)記定量鳥槍法蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析A549細(xì)胞在MP感染情況下的差異分泌蛋白質(zhì)組，是探求MP發(fā)病機制高效、可行的研究策略。
　　2.非經(jīng)典分泌途徑，