生物成像用新型發(fā)光探針的研究.pdf

1、活細(xì)胞內(nèi)單分子行為研究和活體動(dòng)物成像已經(jīng)成為熒光生物成像的前沿領(lǐng)域。然而在單分子和活體動(dòng)物這兩種極端的情況下,生物樣品中大量存在的內(nèi)源性熒光物質(zhì)產(chǎn)生的自發(fā)熒光會(huì)對(duì)標(biāo)記分子的熒光信號(hào)產(chǎn)生非常嚴(yán)重的干擾。為了解決生物成像中自發(fā)熒光干擾的問(wèn)題,我們必須開(kāi)發(fā)一些能完全消除自發(fā)熒光干擾的“新型發(fā)光探針”。本論文針對(duì)這一目標(biāo)開(kāi)展研究,主要包括四個(gè)部分。
　　 1.紅色熒光化學(xué)計(jì)量器用于活細(xì)胞內(nèi)Cu2+的熒光成像
　　 從發(fā)光波長(zhǎng)方面

2、考慮,利用生物組織對(duì)紅光和近紅外光的吸收非常弱的特點(diǎn),并考慮到明確生理過(guò)程中銅的濃度和亞細(xì)胞分布的變化情況對(duì)于研究銅的復(fù)雜生理功能和致病機(jī)理具有重要的意義。
　　 我們?cè)O(shè)計(jì)合成了一個(gè)含有高電負(fù)性S原子的羅丹明B衍生物,實(shí)驗(yàn)表明這個(gè)化合物是一個(gè)Cu2+化學(xué)計(jì)量器,對(duì)Cu2+的響應(yīng)表現(xiàn)為紅光區(qū)的發(fā)射增強(qiáng)。利用一個(gè)Cu2+促進(jìn)的羅丹明開(kāi)環(huán)、氧化還原和水解反應(yīng)的識(shí)別機(jī)理,加入Cu2+引起的熒光強(qiáng)度的增加和吸收強(qiáng)度的增加相當(dāng),說(shuō)明以此化學(xué)

3、計(jì)量器為探針可以有效地避免Cu2+順磁性造成的熒光淬滅。更重要的是,這個(gè)探針能快速(響應(yīng)時(shí)間≤1min)、高靈敏(檢出限≤10ppb)、高選擇地識(shí)別Cu2+。單光子、雙光子熒光成像及臺(tái)盼藍(lán)細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)證實(shí)該探針可以用于檢測(cè)活細(xì)胞中的Cu2+,顯示Cu2+的亞細(xì)胞分布。
　　 2.磷光重金屬配合物用于活細(xì)胞磷光成像
　　 利用磷光重金屬配合物為探針,結(jié)合時(shí)間分辨成像技術(shù),可以區(qū)分來(lái)自標(biāo)記物的壽命較長(zhǎng)的發(fā)光(～μs)和壽命較

4、短的自發(fā)熒光(～ns),有望完全消除自發(fā)熒光的干擾。銥配合物是一類性質(zhì)優(yōu)異的磷光重金屬配合物,但其在生物成像中的應(yīng)用尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。
　　 首先,我們合成了兩個(gè)具有明亮的綠光和紅光發(fā)射的陽(yáng)離子型銥配合物,并且證明了它們是特異性染色活細(xì)胞胞漿的磷光染料。這兩個(gè)銥配合物在緩沖溶液中發(fā)光效率較高,很容易穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞,專一性地染色細(xì)胞的胞漿區(qū)域,且細(xì)胞毒性低,光穩(wěn)定性相較于有機(jī)染料DAPI有所提高,是一類性能優(yōu)良的小分子磷光探針。

5、其次,我們將一個(gè)對(duì)組氨酸有發(fā)光響應(yīng)的銥配合物用于細(xì)胞成像,發(fā)現(xiàn)它能快速且特異性地染色活細(xì)胞和固定細(xì)胞的細(xì)胞核,并僅在細(xì)胞核區(qū)域表現(xiàn)出明亮的發(fā)光。
　　 3.稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料用于激光掃描上轉(zhuǎn)換發(fā)光顯微成像(LSUCLM)
　　 稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料(UCNPs)在980nm連續(xù)光激發(fā)下具有獨(dú)特的上轉(zhuǎn)換發(fā)光過(guò)程,是一類非常有潛力的生物標(biāo)記材料。
　　 我們發(fā)現(xiàn)UCNPs上轉(zhuǎn)換發(fā)光的成像形式非常特殊,非焦面的上

6、轉(zhuǎn)換發(fā)光信號(hào)會(huì)使焦面細(xì)節(jié)完全模糊,導(dǎo)致圖像分辨率很差。通過(guò)引入反式的激發(fā)二色分鏡和共聚焦針孔技術(shù),我們成功地消除了非焦面的上轉(zhuǎn)換發(fā)光的干擾,并且發(fā)展了一種新的三維成像方法,即激光掃描上轉(zhuǎn)換發(fā)光顯微成像(LSUCLM)技術(shù)。隨后,通過(guò)對(duì)UCNPs摻雜的薄膜、有機(jī)熒光染料和UCNPs同時(shí)標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行成像實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)以UCNPs為發(fā)光探針的LSUCLM擁有很多獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),如對(duì)有機(jī)染料和UCNPs的光漂白均非常低,完全消除了來(lái)自內(nèi)源性熒光物

7、質(zhì)和同時(shí)標(biāo)記的熒光染料的背景干擾,還可以與普通共聚焦熒光成像系統(tǒng)聯(lián)用等。
　　 4.放射性核素標(biāo)記的稀土納米晶用于正電子發(fā)射斷層掃描(PET)和上轉(zhuǎn)換發(fā)光雙模式成像
　　 PET技術(shù)具有最高的活體成像靈敏度;而對(duì)細(xì)胞和組織顯像一般采用熒光成像方式。因此,開(kāi)發(fā)同時(shí)具有放射性和熒光的探針可以構(gòu)造出用于多尺度成像的顯像劑。
　　 我們利用18F-和稀土離子發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的原理,發(fā)展了一個(gè)簡(jiǎn)單、快速、高效的方法制備了