胃泌素調(diào)節(jié)激素(OXM)在雙歧桿菌中的表達(dá)及其轉(zhuǎn)基因雙歧桿菌對(duì)肥胖小鼠食量、體重的影響.pdf

1、目的: 構(gòu)建oxyntomodulin基因的雙歧桿菌表達(dá)載體，并用此表達(dá)載體轉(zhuǎn)化長(zhǎng)雙歧桿菌，觀察目的蛋白o(hù)xyntomodulin在雙歧桿菌內(nèi)的表達(dá)及其對(duì)小鼠攝食量和體重的影響。 方法: 以長(zhǎng)雙歧桿菌的基因組DNA為模板擴(kuò)增復(fù)制子和多聚酶基因序列。PCR擴(kuò)增來(lái)源于雙歧桿菌的信號(hào)肽基因，保留克隆質(zhì)粒pBAD-A的氨芐抗性基因和啟動(dòng)子基因，在多克隆位點(diǎn)Bst1107上插入雙歧桿菌質(zhì)粒復(fù)制子及聚合酶序列（BLP），并用

2、來(lái)源于雙歧桿菌的信號(hào)肽序列取代原質(zhì)粒pBAD-A中基因Ⅲ序列。在BpiⅠ和XbaⅠ之間插入報(bào)告基因GFP基因序列（GFP）。BpiⅠ和XbaⅠ雙酶切除大腸桿菌-雙歧桿菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒載體pBADs-GFP中GFP基因序列，酶切產(chǎn)物與OXM目的片段進(jìn)行連接反應(yīng)，獲得含OXM目的片段的大腸桿菌-雙歧桿菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒載體PBBADs-OXM。以電穿孔法將此表達(dá)載體PBBADs-OXM轉(zhuǎn)化B．longum NCC2705，于氨芐陽(yáng)性MRS培養(yǎng)基中

3、，37℃厭氧培養(yǎng)。做革蘭氏染色，顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)化后B．longumNCC2705形態(tài)。以轉(zhuǎn)化后B．longum基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增16s片段。以此雙歧桿菌質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增OXM片段。以終濃度為0．2%的阿拉伯糖誘導(dǎo)培養(yǎng)PBBADs-OXM轉(zhuǎn)化的B．longum，于0、12、24、48小時(shí)分別留取菌體和菌液。提取菌體中蛋白。ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中OXM，以50ug總蛋白WESTERNBLOT。取斷乳昆明小鼠，隨機(jī)取8只小鼠給予

4、正常飲食，其余小鼠給予高脂飲食，構(gòu)建肥胖小鼠模型。取肥胖小鼠32只，隨機(jī)分為模型組，陰性對(duì)照組，OXM組，陽(yáng)性對(duì)照組，每組8只小鼠。陰性對(duì)照組小鼠給予阿拉伯糖（終濃度0．2%）誘導(dǎo)的B．longum NCC2705菌液0．9ml灌胃，OXM組小鼠，給予阿拉伯糖誘導(dǎo)的PBBADs-OXM轉(zhuǎn)化B．longum菌液0．9ml灌胃，陽(yáng)性對(duì)照組小鼠，給予賽尼可1g/kg灌胃，計(jì)各組小鼠每天食物攝取量，每周稱量體重。30天后處死動(dòng)物，檢測(cè)血漿甘油三

5、酯水平。另取2月齡昆明小鼠36只，隨機(jī)分為3組，正常組給與生理鹽水0．9ml灌胃；陰性對(duì)照組給與阿拉伯糖誘導(dǎo)后的B．longum NCC2705菌液0．9ml灌胃，OXM組給與阿拉伯糖誘導(dǎo)后的PBBADs-OXM轉(zhuǎn)化雙歧桿菌菌液0．9ml灌胃；每日下午，3組均給與13C標(biāo)記的棕櫚酸，六天后，處死動(dòng)物。酶聯(lián)免疫法檢測(cè)小鼠血清中oxyntomodulin和Ghrelin表達(dá)濃度。質(zhì)譜法檢測(cè)13C/總碳比，觀察各組小鼠脂肪代謝。 結(jié)果

6、: 未攜帶來(lái)源于雙歧桿菌質(zhì)粒的復(fù)制子和聚合酶序列BLP的對(duì)照質(zhì)粒pBS-GFP轉(zhuǎn)化菌不能形成菌落，而攜帶BLP序列的重組質(zhì)粒有菌落形成，并且此菌落中細(xì)菌保留了長(zhǎng)型雙歧桿菌的典型形態(tài)。PCR擴(kuò)增在800bp和100bp處見(jiàn)條帶出現(xiàn)。分別代表16s和OXM基因片段的形成。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)結(jié)果顯示Oxyntomodulin在PBBADs-OXM轉(zhuǎn)化的B．longum NCC2705培養(yǎng)液上清和菌體沉淀中均有表達(dá)，且上清的表達(dá)水平高于菌

7、體沉淀中的水平。WESTERNBLOTING顯示：轉(zhuǎn)化雙歧桿菌在0．2%阿拉伯糖誘導(dǎo)后，在4KD-5KD之間可見(jiàn)蛋白表達(dá)條帶。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)結(jié)果顯示Oxyntomodulin在PBBADs-OXM轉(zhuǎn)化的B．longum NCC2705培養(yǎng)液上清和菌體沉淀中均有表達(dá)，且上清的表達(dá)水平高于菌體沉淀中的水平。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察到：經(jīng)過(guò)口服阿拉伯糖誘導(dǎo)的pBBADs-OXM轉(zhuǎn)化雙歧桿菌菌液或賽尼可后，肥胖小鼠的食物攝取量與模型組小鼠比較顯著減少。O

8、XM組小鼠食量達(dá)正常小鼠水平。體重比較結(jié)果顯示模型組小鼠體重顯著高于正常組（P<0．05），經(jīng)過(guò)灌飼阿拉伯糖誘導(dǎo)的pBBADs-OXM轉(zhuǎn)化雙歧桿菌菌液，肥胖小鼠體重下降，顯著低于模型組。而長(zhǎng)雙歧桿菌B．longum NCC2705處理的小鼠其體重下降不顯著，體重與模型組無(wú)差異（P>0．05）。血漿甘油三酯檢測(cè)結(jié)果：正常組血漿血脂：1．957±0．238mmol/L；模型組：5．468±0．759mmol/L；陰性對(duì)照組：2．021±0．

9、177 mmol/L； OXM組：1．661±0．137 mmol/L；陽(yáng)性對(duì)照組：1．692±0．486 mmol/L。模型組血漿甘油三酯顯著高于正常組，OXM組甘油三酯水平顯著低于模型組（P<0．05）。ELISA方法檢測(cè)顯示小鼠血清中OXM水平分別為：NS組，36．183±3．876pg/mL；陰性對(duì)照組，38．233±4．139pg/mL；OXM組，37．044±4．870 pg/mL，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0．05）。 各

10、組小鼠血清中Ghrelin均值分別為：NS組，23．680±3．639pg/mL；陰性對(duì)照組32．145±1．571pg/mL；OXM組12．277±580pg/mL。OXM組血清中Ghrelin與陰性對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0．05） 質(zhì)譜分析各組13C/總碳比比值分別為：NS組：-20．033±0．056；OXM組：-21．191±0．043；陰性對(duì)照組：-21．225±0．049。各組之間無(wú)差異。 結(jié)論: