原硅酸通過BMP-2-Smad-RUNX2信號通路促進成骨細胞分化的機制研究.pdf

1、目的:
　　1.探討原硅酸(orthosilicic acid)是否通過上調(diào)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bonemorphogenetic protein2,BMP-2)的表達來促進大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(bonemarrow mesenchymal stem cells，BMSCs)向成骨細胞分化。
　　2.明確原硅酸是否通過BMP-2/Smad1/5/RUNX2信號通路促進成骨細胞表達一型膠原(collagen type1,COL-

2、1)和骨鈣素。
　　方法:
　　分別向大鼠BMSCs中加入不同濃度（0、5、10、20、50μM）的原硅酸，作用48h后，Western blot法檢測BMP-2的表達;向大鼠BMSCs中加入濃度為10μM的原硅酸，分別作用不同的時間(0、24、48、72 h)后，Western blot法檢測BMP-2的表達;使用BMP-2拮抗劑noggin預先處理細胞2h，Western blot法檢測BMP-2的表達;分別向大鼠BMS

3、Cs中加入不同濃度(0、5、10、20、50μM)的原硅酸，作用72 h后，Western blot法檢測COL-1的表達;向大鼠BMSCs中加入濃度為10μM的原硅酸，分別作用不同的時間(0、48、72、96 h)后，Western blot法檢測COL-1的表達;向大鼠BMSCs中加入不同濃度(0、5、10、20、50μM)的原硅酸作用7d后，以及使用noggin預先處理細胞2h后，均用微量酶標法檢測細胞堿性磷酸酶(ALP)的活性;

4、向大鼠BMSCs中分別加入不同濃度（0、10μM）的原硅酸作用21d后，細胞茜素紅鈣染色法檢測鈣結(jié)節(jié)的生成量;分別向人成骨肉瘤細胞MG-63和U2-OS細胞系中加入不同濃度(0、10、20、50μM)的原硅酸，作用72h后，Western blot法檢測COL-1、骨鈣素及BMP-2/Smad/RUNX2信號通路相關蛋白的表達。使用noggin預先處理細胞2h，Western blot法檢測BMP-2、P-Smad1/5和RUNX2的表

5、達;在MG-63細胞系中加入不同濃度（0、10μM）原硅酸，細胞免疫熒光法檢測BMP-2、P-Smad1/5和RUNX2。微量酶標法檢測不同濃度(0、10、20、50μM)原硅酸對MG-63細胞內(nèi)ALP活性的影響。
　　結(jié)果:
　　BMSCs分別經(jīng)0、5、10、20、50μM原硅酸處理48h，5μM原硅酸開始使BMP-2表達增多，濃度為10μM時，BMP-2表達水平最高，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，但隨著

6、原硅酸濃度的增加，到50μM時，原硅酸對BMP-2的表達無明顯的促進作用(P＞0.05);經(jīng)10μM原硅酸分別處理BMSCs24 h、48 h后，與對照組相比，細胞內(nèi)BMP-2的表達較對照組均增加(P＜0.05)，其中48 h時，BMP-2的表達水平最高。處理72 h時，BMP-2表達水平下降并接近于對照組水平(P＞0.05);使用BMP-2的拮抗劑noggin(100ng/ml)預先處理BMSCs2 h后，可以顯著阻斷原硅酸對BMP-

7、2表達的上調(diào)作用;BMSCs分別經(jīng)0、5、10、20、50μM原硅酸處理72 h后，與對照組相比，COL-1的表達均明顯增高(P＜0.05)，其中濃度為10μM時，COL-1的表達水平最高，濃度為50μM時，COL-1表達水平下降并接近于對照組水平(P＞0.05);經(jīng)10μM原硅酸分別處理BMSCs48 h、72 h、96 h后，與對照組相比，COL-1表達明顯升高(P＜0.05)。其中處理72 h時，COL-1的表達水平較48 h、9

8、6 h時高;在原硅酸濃度分別為10和20μM條件下，ALP的活性相對于對照組是升高的(P＜0.05)，其中10μM時最高。50μM條件下，相對于對照組，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。預先使用noggin(100 ng/ml)處理BMSCs2 h，能夠顯著阻斷原硅酸對ALP活性的促進作用;相對于對照組，應用10μM原硅酸作用細胞21 d，能夠明顯增加細胞中鈣結(jié)節(jié)的數(shù)量;10μM原硅酸作用于MG-63和U2-OS細胞系72h，能顯著促進

9、BMP-2、P-Smad1/5、RUNX2、COL-1和骨鈣素的表達。在此條件下，ALP的活性也顯著增加，并且細胞免疫熒光陽性率較對照組明顯升高;Noggin能夠阻斷原硅酸對P-Smad1/5、RUNX2、COL-1表達的上調(diào)作用。
　　結(jié)論:
　　1.原硅酸能夠促進大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化，并且BMP-2的表達上調(diào)可能是這一過程中的重要作用機制之一。
　　2.原硅酸通過BMP-2/Smad1/5/RUNX2