AGEs-RAGE通過(guò)MAPK信號(hào)通路促進(jìn)大鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化.pdf

1、目的：觀察經(jīng)體外培養(yǎng)的大鼠骨髓來(lái)源內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells, EPCs)能否在經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)下向成骨細(xì)胞分化,探討AGEs及其膜受體蛋白 RAGE是否能促進(jìn) EPCs成骨分化以及 MAPK信號(hào)通路在EPCs成骨分化的發(fā)生、發(fā)展中所起的作用。
　　方法：（1）選取體重為120-150g的大鼠，以頸椎脫臼法快速處死，經(jīng)75％酒精浸泡消毒后，于超凈工作臺(tái)中分離出雙下肢股骨及脛骨，收集骨髓液，用密度

2、梯度離心法從下肢骨髓獲取單個(gè)核細(xì)胞并使用EGM-2MV培養(yǎng)基進(jìn)行體外培養(yǎng)。分別于第3、7、14d時(shí)在倒置相差顯微鏡下對(duì)已貼壁細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察,在培養(yǎng)第7d時(shí)對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行雙染鑒定，熒光顯微鏡下觀察到的 FITC標(biāo)記荊豆凝血素I(FITC-UEA-I)和DiI-標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍?DiI-acLDL)雙染色陽(yáng)性細(xì)胞即為正在分化的EPCs。（2）培養(yǎng)細(xì)胞中加入不同濃度AGEs作用7天,提取細(xì)胞蛋白檢測(cè)不同濃度的AGEs作用后EP

3、Cs的鈣化蛋白表達(dá)情況,選定20mg/ml AGEs濃度作為最適濃度后，以10mmol/lβ-甘油磷酸+20mg/ml AGEs干預(yù)EPCs7天，免疫熒光法于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞表型的變化。使用第二代內(nèi)皮祖細(xì)胞，傳代后培養(yǎng)三天，然后分別加入EGM-2MV培養(yǎng)基、含20mg/ml AGEs的EGM-2MV培養(yǎng)基、含10mmol/lβ-甘油磷酸的EGM-2MV培養(yǎng)基、含10mmol/lβ-甘油磷酸+20mg/ml AGEs的EGM-2MV培

4、養(yǎng)基，干預(yù)處理7天，western blot觀察鈣化蛋白表達(dá)的變化。（3）設(shè)計(jì)沉默RAGE的siRNA，構(gòu)建shRNA，用慢病毒載體進(jìn)行包裝，加入到二代EPCs中，用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率以及最適MOI值，提取細(xì)胞蛋白，用western blot觀察RAGE蛋白變化確定轉(zhuǎn)染效果。將細(xì)胞分為對(duì)照組、20mg/ml AGEs組、20mg/ml AGEs+空病毒轉(zhuǎn)染組、20mg/ml AGEs+病毒處理組，培育7天，用 western blo

5、t法觀察細(xì)胞鈣化蛋白變化。（4）在細(xì)胞中加入20mg/ml AGEs，分別于0、5、15、30min時(shí)終止干預(yù)，提取細(xì)胞蛋白，用western blot觀察AGEs對(duì)磷酸化MAPK通路蛋白的影響。將培養(yǎng)三天的二代EPCs分為三組，即對(duì)照組、加入MAPK通路抑制劑組（PD9805950umol/l、SB20358020umol/l、SP60012550umol/l）、DMSO組預(yù)處理1h，更換培養(yǎng)基，加入20mg/ml的AGEs處理5mi

6、n，觀察相關(guān)蛋白表達(dá)變化檢測(cè)抑制劑作用效果。將細(xì)胞分為對(duì)照組、AGEs組、AGEs+PD98059組、AGEs+SB203580組、AGEs+SP600125組，其中加入抑制劑組先用抑制劑干預(yù)24h，再更換培養(yǎng)基，加入AGEs培養(yǎng)7天，提取蛋白觀察細(xì)胞鈣化相關(guān)蛋白的變化。
　　結(jié)果：（1）從骨髓獲取的單個(gè)核細(xì)胞在體外經(jīng)EGM-2MV培養(yǎng)基培養(yǎng)后，在第3天時(shí)可觀察到較多貼壁的體積較大的圓形細(xì)胞，第7天時(shí)出現(xiàn)集落生長(zhǎng)、長(zhǎng)梭狀、“紡錘樣

7、”形態(tài)的細(xì)胞，經(jīng)“雙染”實(shí)驗(yàn)鑒定為正在分化的EPCs，第12-14天時(shí)已出現(xiàn)典型的“鋪路石”樣形態(tài)。（2）經(jīng)β-甘油磷酸+AGEs干預(yù)后，EPCs免疫熒光觀察下內(nèi)皮祖細(xì)胞的表型明顯減低，而成骨樣表型明顯增多，且提取細(xì)胞蛋白行western blot檢測(cè)到鈣化相關(guān)蛋白的表達(dá)也明顯增多。（3）加入AGEs刺激后細(xì)胞的RAGE蛋白表達(dá)明顯增多，經(jīng)siRAGE慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞RAGE蛋白表達(dá)明顯減低，經(jīng)AGEs處理后，相對(duì)于對(duì)照組及空載體轉(zhuǎn)染組，

8、慢病毒轉(zhuǎn)染組的鈣化蛋白明顯減低。（4）經(jīng)AGEs處理后，EPCs磷酸化ERK1/2、p38MAPK、JNK1/2表達(dá)均有所增加，經(jīng)抑制劑處理后再用AGEs刺激，MAPK磷酸化蛋白表達(dá)明顯減低。相較于AGEs對(duì)照組，經(jīng)SB203580、SP600125處理后再用AGEs處理的細(xì)胞鈣化相關(guān)蛋白的表達(dá)明顯減低，而經(jīng)PD98059預(yù)處理的細(xì)胞鈣化蛋白表達(dá)與AGEs組變化不明顯。
　　結(jié)論：（1）EPCs在特定的環(huán)境下可以被誘導(dǎo)向成骨細(xì)胞分