補(bǔ)腎中藥血清對(duì)成骨細(xì)胞中BMP2、7與Smad1-5信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白活性的影響.pdf

1、目的：
　　 通過(guò)研究補(bǔ)腎中藥血清對(duì)離體SD大鼠成骨細(xì)胞中BMP2、BMP7、Smad1/5在細(xì)胞中活性的變化，探討骨質(zhì)疏松癥病機(jī)的分子生物學(xué)機(jī)制；研究補(bǔ)腎益髓壯骨中藥防治骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)理，從而為臨床防治骨質(zhì)疏松癥提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 材料與方法：
　　 采用多次膠原酶消化法獲取新生SD大鼠顱蓋骨中的成骨細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，并應(yīng)用Gomori改良鈣鈷法對(duì)其進(jìn)行堿性磷酸酶表達(dá)的鑒定。隨機(jī)將實(shí)驗(yàn)用大鼠分為正常

2、組、骨疏康顆粒對(duì)照組（骨疏康組）、補(bǔ)腎中藥組（補(bǔ)腎組）、補(bǔ)中益氣顆粒對(duì)照組（補(bǔ)脾組）；對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠給藥干預(yù)8天后，通過(guò)血清藥理學(xué)的方法使用各組大鼠血清培養(yǎng)成骨細(xì)胞48小時(shí)，另設(shè)加入U(xiǎn)PP通路的蛋白酶體抑制劑MG132作為對(duì)照組；應(yīng)用MTT法檢測(cè)離體成骨細(xì)胞的增殖率，并應(yīng)用免疫組化SABC法檢測(cè)成骨細(xì)胞中BMP2、BMP7、Smad1/5活性的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1補(bǔ)腎中藥血清作用于體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞48小時(shí)后可以明

3、顯促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖（P<0.01）。
　　 2應(yīng)用UPP通路蛋白酶體抑制劑MG132可以明顯抑制成骨細(xì)胞的增殖（P<0.01）。
　　 3成骨細(xì)胞堿性磷酸酶染色結(jié)果：成骨細(xì)胞經(jīng)Gomori改良鈣鈷法染色和蘇木精復(fù)染后，可見(jiàn)棕黑色細(xì)微顆粒，多數(shù)分布于細(xì)胞膜上以及周?chē)?，胞漿中也可見(jiàn)到少量顆粒。陰性對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)無(wú)棕黑色顆粒，細(xì)胞核內(nèi)可見(jiàn)嗜蘇木精之藍(lán)色顆粒。
　　 4成骨細(xì)胞BMP2免疫組化結(jié)果：與正常組比較，骨疏康組

4、和補(bǔ)腎組表達(dá)水平明顯上升（P<0.01）；補(bǔ)脾組、MG132+正常組、MG132+骨疏康組、MG132+補(bǔ)腎組和MG132+補(bǔ)脾組表達(dá)水平明顯降低（P<0.01）。與補(bǔ)腎組比較，各組的表達(dá)水平均明顯降低（P<0.01）。
　　 5成骨細(xì)胞BMP7免疫組化結(jié)果：與正常組相比，補(bǔ)腎組表達(dá)水平明顯上升（P<0.01）；骨疏康組、補(bǔ)脾組、MG132+正常組、MG132+骨疏康組、MG132+補(bǔ)腎組和MG132+補(bǔ)脾組表達(dá)水平明顯降低（P

5、<0.01）。與補(bǔ)腎組比較，各組表達(dá)水平均明顯降低（P<0.01）。加入MG132的各含藥血清組中，MG132+正常組表達(dá)水平最高，MG132+補(bǔ)腎組與MG132+正常組比較其陽(yáng)性表達(dá)水平降低（P<0.01）。
　　 6成骨細(xì)胞Smad1/5免疫組化結(jié)果：與正常組相比，補(bǔ)腎組、骨疏康組、補(bǔ)脾組、MG132+正常組、MG132+骨疏康組、MG132+補(bǔ)腎組和MG132+補(bǔ)脾組表達(dá)水平明顯降低（P<0.01）。與補(bǔ)腎組比較，骨疏康組

6、、補(bǔ)脾組、MG132+正常組、MG132+骨疏康組、MG132+補(bǔ)腎組和MG132+補(bǔ)脾組表達(dá)水平明顯降低（P<0.01）。加入MG132的各含藥血清組中，MG132+正常組表達(dá)水平最高，MG132+補(bǔ)腎組與MG132+正常組比較陽(yáng)性表達(dá)水平降低（P<0.01）；MG132+補(bǔ)腎組與MG132+骨疏康組、MG132+補(bǔ)脾組比較陽(yáng)性表達(dá)水平上升（P<0.01）。
　　 結(jié)論：
　　 1采用多次膠原酶消化法獲取大鼠成骨細(xì)胞進(jìn)

7、行體外培養(yǎng)的方法是可靠、簡(jiǎn)便、易行的，可以提供大量高純度的成骨細(xì)胞用于科學(xué)研究使用。
　　 2體外培養(yǎng)的新生大鼠顱蓋骨中存在BMP2、BMP7和Smad1/5的活性表達(dá)，表明正常大鼠成骨細(xì)胞中存在BMP-Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　 3補(bǔ)腎中藥血清可以明顯促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，明顯升高成骨細(xì)胞中BMP2、BMP7和Smad1/5的表達(dá)水平，提示補(bǔ)腎益髓壯骨中藥具有防治骨質(zhì)疏松癥的作用。
　　 4應(yīng)用UPP通路的蛋白