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文檔簡介
1、目的:
通過研究補腎中藥血清對離體SD大鼠成骨細胞中BMP2、BMP7、Smad1/5在細胞中活性的變化,探討骨質(zhì)疏松癥病機的分子生物學機制;研究補腎益髓壯骨中藥防治骨質(zhì)疏松癥的作用機理,從而為臨床防治骨質(zhì)疏松癥提供科學的實驗依據(jù)。
材料與方法:
采用多次膠原酶消化法獲取新生SD大鼠顱蓋骨中的成骨細胞進行體外培養(yǎng),并應用Gomori改良鈣鈷法對其進行堿性磷酸酶表達的鑒定。隨機將實驗用大鼠分為正常
2、組、骨疏康顆粒對照組(骨疏康組)、補腎中藥組(補腎組)、補中益氣顆粒對照組(補脾組);對實驗大鼠給藥干預8天后,通過血清藥理學的方法使用各組大鼠血清培養(yǎng)成骨細胞48小時,另設(shè)加入UPP通路的蛋白酶體抑制劑MG132作為對照組;應用MTT法檢測離體成骨細胞的增殖率,并應用免疫組化SABC法檢測成骨細胞中BMP2、BMP7、Smad1/5活性的表達。
結(jié)果:
1補腎中藥血清作用于體外培養(yǎng)的成骨細胞48小時后可以明
3、顯促進成骨細胞的增殖(P<0.01)。
2應用UPP通路蛋白酶體抑制劑MG132可以明顯抑制成骨細胞的增殖(P<0.01)。
3成骨細胞堿性磷酸酶染色結(jié)果:成骨細胞經(jīng)Gomori改良鈣鈷法染色和蘇木精復染后,可見棕黑色細微顆粒,多數(shù)分布于細胞膜上以及周圍,胞漿中也可見到少量顆粒。陰性對照組細胞內(nèi)無棕黑色顆粒,細胞核內(nèi)可見嗜蘇木精之藍色顆粒。
4成骨細胞BMP2免疫組化結(jié)果:與正常組比較,骨疏康組
4、和補腎組表達水平明顯上升(P<0.01);補脾組、MG132+正常組、MG132+骨疏康組、MG132+補腎組和MG132+補脾組表達水平明顯降低(P<0.01)。與補腎組比較,各組的表達水平均明顯降低(P<0.01)。
5成骨細胞BMP7免疫組化結(jié)果:與正常組相比,補腎組表達水平明顯上升(P<0.01);骨疏康組、補脾組、MG132+正常組、MG132+骨疏康組、MG132+補腎組和MG132+補脾組表達水平明顯降低(P
5、<0.01)。與補腎組比較,各組表達水平均明顯降低(P<0.01)。加入MG132的各含藥血清組中,MG132+正常組表達水平最高,MG132+補腎組與MG132+正常組比較其陽性表達水平降低(P<0.01)。
6成骨細胞Smad1/5免疫組化結(jié)果:與正常組相比,補腎組、骨疏康組、補脾組、MG132+正常組、MG132+骨疏康組、MG132+補腎組和MG132+補脾組表達水平明顯降低(P<0.01)。與補腎組比較,骨疏康組
6、、補脾組、MG132+正常組、MG132+骨疏康組、MG132+補腎組和MG132+補脾組表達水平明顯降低(P<0.01)。加入MG132的各含藥血清組中,MG132+正常組表達水平最高,MG132+補腎組與MG132+正常組比較陽性表達水平降低(P<0.01);MG132+補腎組與MG132+骨疏康組、MG132+補脾組比較陽性表達水平上升(P<0.01)。
結(jié)論:
1采用多次膠原酶消化法獲取大鼠成骨細胞進
7、行體外培養(yǎng)的方法是可靠、簡便、易行的,可以提供大量高純度的成骨細胞用于科學研究使用。
2體外培養(yǎng)的新生大鼠顱蓋骨中存在BMP2、BMP7和Smad1/5的活性表達,表明正常大鼠成骨細胞中存在BMP-Smad信號轉(zhuǎn)導通路。
3補腎中藥血清可以明顯促進成骨細胞的增殖,明顯升高成骨細胞中BMP2、BMP7和Smad1/5的表達水平,提示補腎益髓壯骨中藥具有防治骨質(zhì)疏松癥的作用。
4應用UPP通路的蛋白
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