Blcap和Nnat在小鼠發(fā)育中的表達(dá)及其調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、印記基因Bladder Cancer-Associated Protein(Blcap)和Neuronatin(Nnat)位于小鼠2號(hào)染色體末端。Blcap為父本印記母本表達(dá)，Nnat為母本印記父本表達(dá)，且位于基因Blcap長(zhǎng)為8.5kb的內(nèi)含子中。之前的研究發(fā)現(xiàn)，Blcap和Nnat在轉(zhuǎn)錄本水平可能存在相互作用，但未詳細(xì)闡明。此外，相關(guān)研究推測(cè)，位于NNAT第一外顯子上游1.5kb的三個(gè)潛在CTCF結(jié)合位點(diǎn)的低甲基化與NNAT及BLC

2、AP_V2a在腎母細(xì)胞瘤組織中的高表達(dá)水平有一定關(guān)系。因此，本文以Blcap和Nnat為研究對(duì)象，分析了二者在小鼠胚胎發(fā)育中的表達(dá)模式，轉(zhuǎn)錄水平的相互影響以及CTCF在其表達(dá)調(diào)控中的作用。
　　首先，我們利用原位雜交及定量PCR技術(shù)系統(tǒng)的分析了Blcap及Nnat在小鼠發(fā)育過程中的表達(dá)模式。定量結(jié)果顯示，Blcap和Nnat的表達(dá)水平從E9.5至E13天左右一直呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，并分別在E12.5和E13.5天達(dá)到最高。此后隨著發(fā)育階

3、段的進(jìn)行，到E18.5天過程中兩基因表達(dá)水平都出現(xiàn)了不同程度的下降。通過分析定量PCR及RNA-seq數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，與其他組織相比，Blcap和Nnat在E14.5, E15.5天及成體小鼠中腦組織中高表達(dá)。原位雜交結(jié)果也顯示，Blcap和Nnat在E9.5, E11.5和E15.5天胚胎主要表達(dá)于前腦泡、中腦泡、菱腦泡及間腦等中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，并且在這些神經(jīng)發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期中，Nnat的表達(dá)較Blcap更廣泛、更豐富，特別是Nnat在體節(jié)、前

4、肢、后肢及垂體中都有表達(dá)信號(hào)。腦不同發(fā)育時(shí)期的定量結(jié)果顯示，從 E15.5至 P30天，Blcap在腦組織中的表達(dá)逐漸升高，但Nnat表達(dá)明顯下降。之后，我們通過腦切片原位雜交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了Blcap和Nnat在出生后隨小鼠腦發(fā)育過程的表達(dá)變化情況。結(jié)果顯示，Blcap和Nnat都普遍表達(dá)于新出生小鼠腦組織(P0)。而從 P10到P30天過程中，Blcap的信號(hào)特異表達(dá)于小腦、海馬。隨后，Blcap的表達(dá)水平出現(xiàn)了下降，但在成體小腦的

5、內(nèi)顆粒細(xì)胞層、嗅球及海馬中都有明顯的信號(hào)。然而，不同于Blcap的表達(dá)模式，Nnat的轉(zhuǎn)錄本仍然存在于P10天小鼠整個(gè)腦組織中，但從P10至成體發(fā)育過程中，Nnat表達(dá)出現(xiàn)了明顯下調(diào)，并只在小腦和嗅球中少量表達(dá)。這些結(jié)果提示Blcap和Nnat在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)育中起到重要的作用，特別是與小腦、嗅球及海馬的發(fā)育成熟及功能有密切關(guān)系。
　　其次，為了初步研究Blcap和Nnat的相互調(diào)控，我們?cè)O(shè)計(jì)了靶向這對(duì)印記基因的siRNA，并構(gòu)建了

6、Blcap和Nnat的過表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染 N2a或 NIH-3T3細(xì)胞系。結(jié)果顯示，干擾或過表達(dá)Nnat轉(zhuǎn)錄本后，Blcap的表達(dá)水平并未發(fā)生變化，同樣，干擾或過表達(dá)Blcap后，Nnat的表達(dá)水平也未發(fā)生變化。這些結(jié)果表明說明在轉(zhuǎn)錄水平Blcap和Nnat不存在相互調(diào)控。
　　最后，我們構(gòu)建了靶向敲除Nnat第一外顯子上游的三個(gè)潛在CTCF結(jié)合位點(diǎn)（CTCFBS＃1～CTCFBS＃3）的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，以此來研究此區(qū)域

7、是否作為一個(gè)可以同時(shí)調(diào)節(jié)Blcap和Nnat的印記調(diào)節(jié)區(qū)存在。研究結(jié)果顯示，在敲除此區(qū)域后，Nnat表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)，但是Blcap未發(fā)生明顯變化，這說明在小鼠中，此CTCF結(jié)合區(qū)域可能參與Nnat的表達(dá)調(diào)控，但并不影響B(tài)lcap表達(dá)。
　　綜上所述，本研究分析了Blcap和Nnat在小鼠胚胎及出生后發(fā)育過程中的表達(dá)譜。初步證明了Blcap和Nnat在轉(zhuǎn)錄水平并不存在相互影響，報(bào)道了一個(gè)潛在的影響Nnat表達(dá)的調(diào)控區(qū)域。為后續(xù)Blca