Sonic Hedgehog信號(hào)通路調(diào)控小鼠肺發(fā)育機(jī)制的研究.pdf

1、背景:
　　胚胎的發(fā)育受到不同信號(hào)通路的調(diào)控，以及上皮-間質(zhì)相互作用的影響，不同部位基因表達(dá)的異常激活或缺失，將會(huì)導(dǎo)致一系列的后果，包括引起肺發(fā)育異常的疾病，甚至死亡。正確認(rèn)識(shí)肺發(fā)育過(guò)程中不同信號(hào)通路之間的關(guān)系，了解其作用機(jī)制，對(duì)理解導(dǎo)致人類肺先天發(fā)育異常相關(guān)疾病有所幫助。盡管小鼠與人類的肺的發(fā)育有所不同，但肺發(fā)育早期的分子信號(hào)通路是相對(duì)保守的。
　　Hedgehog(Hh)信號(hào)通路在胚胎時(shí)期的細(xì)胞分化、組織與器官發(fā)育中扮演

2、著重要的角色，主要由三種分泌型糖蛋白配體Sonic Hedgehog(Shh)、IndianHedgehog(Ihh)和Desert Hedgehog(Dhh)，兩個(gè)跨膜蛋白受體Patched1(Ptch1)、Smoothened(Smo)，三個(gè)核轉(zhuǎn)錄因子Gli1、Gli2、Gli3及下游的靶基因等組成。其中，Shh通路在小鼠胚胎肺的發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。在Shh存在的情況下，Shh與Ptch1結(jié)合，解除了Ptch1對(duì)Smo的抑制，Sm

3、o則進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，釋放微管活化的Gli1和Gli2，并使其入核激活下游靶基因的表達(dá)。
　　目的:
　　本課題以Shh信號(hào)通路為研究對(duì)象，利用免疫組化及免疫熒光技術(shù)來(lái)探索小鼠胚胎肺發(fā)育過(guò)程中經(jīng)典Shh信號(hào)通路對(duì)上皮、間質(zhì)轉(zhuǎn)化的必要作用。首先利用免疫組化檢測(cè)Shh通路中關(guān)鍵分子Smo以及血小板源性生長(zhǎng)因子受體-α(platelet-derived growth factor receptor-α;Pdgfr-α)的時(shí)空表達(dá)特點(diǎn)，然

4、后構(gòu)建基因敲除小鼠模型，最后利用Pdgfr-α Cre敲除Smo轉(zhuǎn)基因小鼠模型，探索Shh信號(hào)通路對(duì)小鼠肺發(fā)育的作用及調(diào)控機(jī)制。
　　方法及結(jié)果:
　　首先，我們利用免疫組化檢測(cè)Shh信號(hào)通路受體Smo及Pdgfr-α在小鼠胎肺中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在整個(gè)假腺期，Smo在氣道上皮和肺間質(zhì)中均有表達(dá);而在微管期，Smo的表達(dá)量迅速下降。假腺期Pdgfr-α在近端氣道中表達(dá)，E12.5天Pdgfr-α在遠(yuǎn)端肺上皮細(xì)胞以及部分包

5、繞著氣管、支氣管、細(xì)支氣管周圍的間質(zhì)細(xì)胞表達(dá);E14.5天，Pdgfr-α的表達(dá)嚴(yán)格限制在大支氣管周圍，與支氣管平滑肌細(xì)胞毗鄰的間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)Pdgfr-α，但在遠(yuǎn)端肺中未被發(fā)現(xiàn)有Pdgfr-α的表達(dá)。微管期，Pdgfr-α出現(xiàn)在更遠(yuǎn)端的肺間質(zhì)。
　　然后，利用Pdgfr-α Cre敲除Smo基因，構(gòu)建基因敲除小鼠模型（由美國(guó)南加州大學(xué)/洛杉磯縣兒童醫(yī)院饋贈(zèng)）。
　　最后，利用免疫熒光檢測(cè)Shh信號(hào)通路受體Smo基因用Pdgf

6、r-αCre敲除后對(duì)小鼠肺發(fā)育的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組肺相比，E12.5-E15.5天基因敲除組小鼠的肺體積縮小，支氣管分支形成減少，TTF-1表達(dá)水平的下調(diào)，而E16.5天支氣管分支及TTF-1水平未見(jiàn)明顯差異。E12.5-E15.5天支氣管間質(zhì)產(chǎn)生軟骨基質(zhì)硫酸軟骨素的量下調(diào)，氣管環(huán)形成滯后，氣管狹窄，而E16.5未見(jiàn)明顯差異。E12.5-E13.5天，實(shí)驗(yàn)組近端及遠(yuǎn)端α-Sma的表達(dá)較對(duì)照組上調(diào);E14.5實(shí)驗(yàn)組近端α-Sma的表

7、達(dá)上調(diào)，遠(yuǎn)端α-Sma的表達(dá)未見(jiàn)明顯變化;E15.5-E16.5天，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組近端及遠(yuǎn)端α-Sma的表達(dá)未見(jiàn)明顯差異。E12.5-E15.5天近端上皮標(biāo)志物P63表達(dá)下調(diào)，而在E16.5天，P63表達(dá)無(wú)明顯改變。在E12.5-E14.5天，均未見(jiàn)β4-tublin的表達(dá)，E15.5天遠(yuǎn)端上皮指標(biāo)β4-tublin的表達(dá)量下降，E16.5天β4-tublin表達(dá)無(wú)明顯改變。
　　結(jié)論:
　　綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Shh信號(hào)通