Sonic Hedgehog信號通路調控小鼠肺發(fā)育機制的研究.pdf

1、背景:
　　胚胎的發(fā)育受到不同信號通路的調控，以及上皮-間質相互作用的影響，不同部位基因表達的異常激活或缺失，將會導致一系列的后果，包括引起肺發(fā)育異常的疾病，甚至死亡。正確認識肺發(fā)育過程中不同信號通路之間的關系，了解其作用機制，對理解導致人類肺先天發(fā)育異常相關疾病有所幫助。盡管小鼠與人類的肺的發(fā)育有所不同，但肺發(fā)育早期的分子信號通路是相對保守的。
　　Hedgehog(Hh)信號通路在胚胎時期的細胞分化、組織與器官發(fā)育中扮演

2、著重要的角色，主要由三種分泌型糖蛋白配體Sonic Hedgehog(Shh)、IndianHedgehog(Ihh)和Desert Hedgehog(Dhh)，兩個跨膜蛋白受體Patched1(Ptch1)、Smoothened(Smo)，三個核轉錄因子Gli1、Gli2、Gli3及下游的靶基因等組成。其中，Shh通路在小鼠胚胎肺的發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。在Shh存在的情況下，Shh與Ptch1結合，解除了Ptch1對Smo的抑制，Sm

3、o則進入細胞內，釋放微管活化的Gli1和Gli2，并使其入核激活下游靶基因的表達。
　　目的:
　　本課題以Shh信號通路為研究對象，利用免疫組化及免疫熒光技術來探索小鼠胚胎肺發(fā)育過程中經典Shh信號通路對上皮、間質轉化的必要作用。首先利用免疫組化檢測Shh通路中關鍵分子Smo以及血小板源性生長因子受體-α(platelet-derived growth factor receptor-α;Pdgfr-α)的時空表達特點，然

4、后構建基因敲除小鼠模型，最后利用Pdgfr-α Cre敲除Smo轉基因小鼠模型，探索Shh信號通路對小鼠肺發(fā)育的作用及調控機制。
　　方法及結果:
　　首先，我們利用免疫組化檢測Shh信號通路受體Smo及Pdgfr-α在小鼠胎肺中的表達情況。結果顯示，在整個假腺期，Smo在氣道上皮和肺間質中均有表達;而在微管期，Smo的表達量迅速下降。假腺期Pdgfr-α在近端氣道中表達，E12.5天Pdgfr-α在遠端肺上皮細胞以及部分包

5、繞著氣管、支氣管、細支氣管周圍的間質細胞表達;E14.5天，Pdgfr-α的表達嚴格限制在大支氣管周圍，與支氣管平滑肌細胞毗鄰的間質細胞表達Pdgfr-α，但在遠端肺中未被發(fā)現(xiàn)有Pdgfr-α的表達。微管期，Pdgfr-α出現(xiàn)在更遠端的肺間質。
　　然后，利用Pdgfr-α Cre敲除Smo基因，構建基因敲除小鼠模型（由美國南加州大學/洛杉磯縣兒童醫(yī)院饋贈）。
　　最后，利用免疫熒光檢測Shh信號通路受體Smo基因用Pdgf

6、r-αCre敲除后對小鼠肺發(fā)育的影響。結果發(fā)現(xiàn)，與對照組肺相比，E12.5-E15.5天基因敲除組小鼠的肺體積縮小，支氣管分支形成減少，TTF-1表達水平的下調，而E16.5天支氣管分支及TTF-1水平未見明顯差異。E12.5-E15.5天支氣管間質產生軟骨基質硫酸軟骨素的量下調，氣管環(huán)形成滯后，氣管狹窄，而E16.5未見明顯差異。E12.5-E13.5天，實驗組近端及遠端α-Sma的表達較對照組上調;E14.5實驗組近端α-Sma的表

7、達上調，遠端α-Sma的表達未見明顯變化;E15.5-E16.5天，實驗組與對照組近端及遠端α-Sma的表達未見明顯差異。E12.5-E15.5天近端上皮標志物P63表達下調，而在E16.5天，P63表達無明顯改變。在E12.5-E14.5天，均未見β4-tublin的表達，E15.5天遠端上皮指標β4-tublin的表達量下降，E16.5天β4-tublin表達無明顯改變。
　　結論:
　　綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Shh信號通