miR-370在小鼠發(fā)育中的表達機制及其對發(fā)育的影響.pdf

1、microRNA（miRNA）是高度保守的小分子非編碼 RNA，通過對靶向基因的負調控作用參與細胞增殖、分化、凋亡、代謝及信號轉導，腫瘤細胞的轉化、胚胎發(fā)育等生命過程。miR-370是一個高度保守的父本印記基因，位于小鼠12號染色體遠端Dlk1-Dio3印記區(qū)內長非編碼RNA Rian的第3內含子中，同源定位于人14號染色體DLK1-DIO3印記域。研究顯示Dlk1-Dio3印記區(qū)間不僅與干細胞多能性關系密切，而且與人類和小鼠的多種遺傳

2、缺陷，發(fā)育遲緩、代謝紊亂等有關。miR-370作為該基因簇中印記miRNA的一員，在小鼠胚胎發(fā)育過程中的表達模式及其對胚胎發(fā)育的影響和功能并不清楚，因此本論文以miR-370為研究對象，利用實時定量PCR和原位雜交的技術確認其在正常小鼠胚期發(fā)育過程中的表達模式；通過生物信息學分析和熒光素酶報告實驗篩選和鑒定其靶基因；并通過構建過表達小鼠模型，驗證活體中miR-370對靶基因的負調控作用，探索轉基因小鼠的表型異常與miR-370富集的潛在

3、關系，初步闡述miR-370的潛在功能。
　　首先，在不同細胞中的定量分析結果顯示，在鼠源的14株細胞系中， miR-370在AtT20、MLTC-1及F93株腫瘤細胞中表達較高，而在正常永生細胞株—TM3、MS5和NIH3T3中表達相對較低。在人的18株細胞系中，miR-370在兩株K562和PANC-1癌細胞系和正常膀胱細胞系（SV-HUC-1）的表達水平較高，而在其他的細胞系中表達相對較低。在小鼠睪丸間質瘤細胞MLTC-1和

4、小鼠睪丸間質細胞 TM3中， miR-370是差異表達的，通過對這兩種細胞Gtl2-DMR區(qū)DNA甲基化分析及5-Aza-CdR處理TM3的細胞實驗顯示miR-370的表達水平受 DNA甲基化調控，但其表達量與細胞的增殖能力沒有直接的聯(lián)系。通過生物信息學預測篩選了小鼠3個候選靶基因（Dnmt3a，Dnmt3b，Itgb8）和人的3個候選靶基因（STAT3，ASB15和SLC4A4），利用熒光素酶報告實驗和Western blot證實，D

5、nmt3a為miR-370的一個靶基因。
　　其次，為了進一步明確miR-370的時空表達模式與胚胎發(fā)育的關系，本課題選取著床前小鼠胚胎進行實時定量 RT-PCR分析，結果顯示在囊胚期之前幾乎檢測不到miR-370成熟體的表達，而在著床時miR-370的表達發(fā)生了顯著的激活。miR-370的激活表達在E9.5達到峰值，并在胚胎中后期維持較高的表達水平，并隨著中后期發(fā)育的進程稍顯降低。全胚胎原位雜交的結果顯示， miR-370在小鼠

6、 E9.5-E11.5胚胎的腦組織和神經(jīng)管中有集中的高表達，暗示可能參與并調控這一時期中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育。而 E15.5天小鼠胚胎切片原位雜交和不同組織間的實時定量RT-PCR分析顯示miR-370是一個具有組織特異性表達的基因，即miR-370在胚期的表達水平遠高于成體組織，且在胚期主要集中于部分腦組織、腎上腺、背根神經(jīng)節(jié)、舌、嗅覺外皮層及多數(shù)骨質原基表達，而在肝、肺、心臟、腎臟等實質性臟器中表達水平較低。
　　為了進一步研究m

7、iR-370在小鼠胚胎發(fā)育中的功能，利用原核注射技術構建了miR-370過表達的轉基因小鼠模型。通過對后代的表型分析發(fā)現(xiàn) miR-370轉基因雄鼠在出生前后體重均有10％左右的增加，而雌性小鼠和胎盤重量變化并不顯著。在轉基因鼠的繁育過程中發(fā)現(xiàn)miR-370轉基因小鼠每胎產(chǎn)子數(shù)較野生型低2.56個，異常死亡個體增多，并偶發(fā)畸胎瘤，且轉基因小鼠每胎雌鼠與雄鼠數(shù)量的比值下降至0.51。通過對轉基因小鼠定量 RT-PCR檢測，miR-370在胚

8、期的表達水平基本正常，個別個體表達高于正常水平的2倍左右。而miR-370在成體轉基因鼠的表達則主要富集在舌和精巢組織，均達到4倍左右。故本研究以精巢組織作為主要的研究對象，并利用 qRT-PCR驗證了miR-370對Dnmt3a在轉錄水平上的靶向性，同時 miR-370和Dnmt3a共定位的實驗證明 miR-370富集與其靶基因 Dnmt3a蛋白存在相似的細胞類型定位，并且表達水平上兩者存在一定程度的負相關。然而在 E18.5天與6周

9、齡成鼠兩個時間節(jié)點上，未能觀測到轉基因小鼠的精巢和對照組在IG-DMR區(qū)的甲基化水平存在明顯的差異。同時發(fā)現(xiàn)過表達miR-370轉基因小鼠，其精巢組織發(fā)生了明顯的表型改變，其中心區(qū)域曲細精管排列松散，曲細精管異常萎縮，睪丸間充質細胞數(shù)目顯著減少，伴隨精子密度偏低，精子質量各項指標出現(xiàn)顯著異常。
　　綜上所述， miR-370是一個在小鼠胚胎發(fā)育過程中時空特異性表達的miRNA，在細胞水平和體內 miR-370均可以靶向甲基轉移酶