EV71病毒抗原蛋白VP1基因重組載體疫苗研究.pdf

1、腸道病毒71型(EV71)是導致手足口病的主要病原體之一,常引起多種與神經系統(tǒng)相關的嚴重疾病。Vp1是EV71病毒主要的抗原基因,其編碼的外衣殼蛋白在感染宿主細胞時起重要作用。因此,我們選擇vp1作為研制EV71疫苗的目標基因。LTB有很強的免疫原性和佐劑活性且無毒。本研究中選用LTB作為分子內粘膜免疫佐劑。
　　 雙歧桿菌正常存在于人類腸道內,是一種重要的有益的生菌,對人體腸道微環(huán)境有重要的調節(jié)功能,對嬰幼兒腸道有獨特的保護作

2、用。雙歧桿菌是人類腸道的自然宿主且可以粘附于腸道上皮細胞。因此,本研究的目的是將雙歧桿菌發(fā)展成一個表達EV71 VP1蛋白和ETECLTB蛋白的雙價口服活疫苗的抗原表達系統(tǒng)。
　　 目的：
　　 構建攜帶EV71病毒vp1基因和ltb基因的融合表達載體并在大腸桿菌和雙歧桿菌中進行表達,鑒定其抗原性和免疫原性。為制備預防EV71感染的口服疫苗奠定基礎。
　　 方法
　　 用重疊延伸PCR(overlap e

3、xtension PCR)法獲得人腸道病毒71型vp1片段與大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(ltb)的融合基因。設計14對引物通過重疊延伸PCR技術合成vp1基因,以ETEC(44815)質粒DNA為模板,PCR擴增ltb基因,將vp1基因與ltb基因連接并測序,連接產物插入原核表達質粒pBEX,構建重組質粒pBEX-VP1-LTB,轉化E.coli B1221(DE3)進行表達,SDS-PAGE及Western blotting分析其表

4、達。將表達VP1-LTB的大腸桿菌超聲破碎后離心提取包涵體制備抗原,經口灌喂免疫小鼠,檢測小鼠血清中抗VP1的IgG、IgA,糞便sIgA和腸粘液sIgA,鑒定其免疫原性。電轉化法將重組質粒pBEX-VP1-LTB轉入雙歧桿菌,Western-blot分析其抗原性?？诜庖逽D大鼠,采集血清和糞便樣品,ELISA檢測機體特異的血清IgG和腸道IgA抗體。
　　 結果
　　 合成的Vp1基因全長891bp,測序結果與預期相

5、符,重組表達質粒pBEX-VP1-LTB經PCR及雙酶切鑒定,表明構建正確;目的蛋白在E.coli BL21(DE3)中獲得了表達,Western-blot分析結果表明該蛋白具有與EV71 VP1抗體結合的抗原性,免疫后小鼠血清抗VP1的IgG、IgA以及糞便sIgA和腸粘液sIgA明顯高于PBS和GST對照組。電轉法成功將重組質粒轉入雙歧桿菌,Western-blot分析結果表明該蛋白具有與EV71病毒抗體結合的抗原性。ELISA檢測

6、表明重組雙歧桿菌免疫后的SD大鼠體內產生了特性的IgG和IgA抗體。
　　 結論
　　 應用重疊延伸PCR技術成功構建了EV71 VP1-LTB融合表達質粒,并在E.coli BL21(DE3)和雙歧桿菌中獲得有生物學功能的VP1表達產物,該蛋白具有良好的抗原性和免疫原性,為研制EV71分子內佐劑疫苗打下了基礎。該研究表明重組載體pBEX-VP1-LTB可以在雙歧桿菌中表達。該重組VP1-LTB基因工程雙歧桿菌可誘發(fā)SD