乳酸桿菌載體口蹄疫病毒VP1 DNA疫苗的研究.pdf

1、當前尚無以乳酸桿菌為載體的DNA疫苗系統(tǒng)建立。本研究應用pRc/CMV2真核表達質(zhì)粒為骨架，先后插入口蹄疫病毒VP1基因和源于L.plantarumATCC8014株的乳酸桿菌復制子基因Rep.8014，構(gòu)建了pRc/CMV2-VP1-Rep.8014真核表達穿梭質(zhì)粒。隨后轉(zhuǎn)染乳酸桿菌，首次建立了乳酸桿菌為載體的FMDV-VP1DNA疫苗系統(tǒng)。 使用RogosaSL完全選擇性培養(yǎng)基，自健康3月齡仔豬胃腸道粘膜分離并初步鑒定乳酸桿

2、菌33株。選取其中20株，應用API鑒定系統(tǒng)進行鑒定。結(jié)果鑒定出嗜酸乳桿菌6株，發(fā)酵乳桿菌5株，戊糖乳桿菌1株，乳明串珠菌1株。隨機選取其中一株嗜酸乳桿菌(L.acidophilusSW1)為疫苗侯選菌株。將構(gòu)建質(zhì)粒pRc/CMV2-VP1-Rep.8014轉(zhuǎn)染PK15細胞，以間接免疫熒光試驗分析了VP1蛋白在細胞的表達。免疫熒光顯示了典型的胞漿著染，胞漿區(qū)具有最亮的熒光，而空載體pRc/CMV2轉(zhuǎn)染細胞無任何熒光。隨后，將pRc/CM

3、V2-VP1-Rep.8014質(zhì)粒電轉(zhuǎn)L.acidophilusSW1株，篩選出帶有口蹄疫VP1基因的乳酸桿菌工程菌株L.acidophilusSFMD-1。為評價L.acidophilusSFMD-1的免疫效果，對免疫小鼠進行了VP1抗體檢測、T細胞增殖、遲發(fā)型超敏反應(DTH)、不同免疫途徑的影響等試驗，同時檢測了免疫后VP1基因的組織分布。結(jié)果表明，L.acidophilusSFMD-1在免疫后21天產(chǎn)生了可檢測水平的抗體。在免疫

4、后第42天，L.acidophilusSFMD-1和商用滅活口蹄疫疫苗抗體水平分別快速上升到6.25(S/N)和5.20，第49天檢測時仍維持在同樣高的抗體水平。免疫途徑對特異性IgG抗體產(chǎn)生強度具有顯著影響。肌肉注射產(chǎn)生了最高水平的FMDV-VP1抗體，然后是腹腔注射、滴鼻和口服途徑。在T細胞增殖試驗中，L.acidophilusSFMD-1免疫組刺激指數(shù)達到2.78，而pRc/CMV2-VP1-Rep.8014質(zhì)粒免疫組刺激指數(shù)為5

5、.08。L.acidophilusSFMD-1免疫鼠能夠引發(fā)T細胞介導的抗原特異性DTH反應。此外，可在免疫鼠的肌肉、腎臟、脾臟和心臟組織檢測到VP1基因，但在肝臟未測出。 隨后，擴展了L.acidophilusSFMD-1的應用范圍，將其用于豬體免疫，同時研究了豬IL-2和IL-6的分子佐劑效應。通過RT-PCR方法從豬的腸系膜淋巴結(jié)克隆豬IL-2和IL-6基因，并將其插入pRc/CMV2載體，構(gòu)建了分別編碼豬IL-2和IL-

6、6的真核表達質(zhì)粒pCSIL2和pCSIL6。以RT-PCR方法分析了這兩個質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK15細胞后的mRNA轉(zhuǎn)錄情況。預期的429bpIL-2帶和605bpIL-6帶僅出現(xiàn)在pCSIL2和pCSIL6轉(zhuǎn)染細胞，在非轉(zhuǎn)染細胞或pRc/CMV2空載體轉(zhuǎn)染細胞無相似大小的條帶出現(xiàn)。通過口服或者肌注途徑，這個疫苗能夠在豬體誘發(fā)VP1特異的T細胞和B細胞反應。以間接ELISA試驗和正向間接血凝試驗(IHA)檢測了L.acidophilusSFMD-

7、1免疫后FMDV-VP1抗體的動態(tài)變化。與肌肉注射途徑相比，口服組在免疫后21天出現(xiàn)了顯著的較高的抗體水平，其效價達到了2.64，而肌肉注射組為1.50。加強免疫后兩周，口服組下降到1.78，然后在第3周迅速上升到2.79。IHA試驗得到了相似的結(jié)果。以MTT方法進行檢測，兩種免疫途徑都可以誘導特異的T細胞增殖反應。與疫苗共同免疫pCSIL2質(zhì)粒能夠增強FMDV-VP1特異的T細胞和B細胞反應，共同免疫pCSIL6可能具有增強特異性B細

8、胞反應的潛力。初次免疫后3周，L.acidophilusSFMD-1和pCSIL6共免疫組出現(xiàn)了明顯的VP1抗體，其抗體水平達到了1.80，而L.acidophilusSFMD-1單獨免疫組以及L.acidophilusSFMD-1和pCSIL2共免疫組的抗體水平分別為1.50和1.66。加強免疫后兩周，三個組的抗體水平都略有下降，在接下來的一周，抗體水平快速上升，分別達到了1.95(L.acidophilusSFMD-1+pCSIL6

9、)，1.83(L.acidophilusSFMD-1)和2.28(L.acidophilusSFMD-1+pCSIL2)。在MTT試驗中，L.acidophilusSFMD-1和pCSIL2共免疫組呈現(xiàn)了最高的刺激反應，然后依次是L.acidophilusSFMD-1組，L.acidophilusSFMD-1和pCSIL6共免疫組。其刺激指數(shù)(SI)分別為2.70，2.00和1.78。試驗結(jié)果清楚地表明，乳酸桿菌為載體是DNA免疫和預防