口蹄疫病毒VP1抗原基因在模式植物葉綠體中的重組和表達.pdf

1、口蹄疫病毒的主要抗原組分為VP1結構蛋白,它能夠誘導機體產(chǎn)生保護性的抗體反應.最近利用轉(zhuǎn)基因植物表達的口蹄疫病毒VP1蛋白注射和飼喂小鼠后,能夠誘導其體內(nèi)產(chǎn)生特異性中和抗體,并使小鼠得到有效的免疫保護.另外作用轉(zhuǎn)基因植物表達口蹄疫病毒VP1抗原蛋白具有安全廉價、蛋白折疊充分、免疫原性良好等特點.同時植物細胞還是一種理想的口服疫苗保護載體,在其中表達的抗原蛋白甚至無須純化,可以直接口服免疫.但是抗原蛋白在植物生物反應器中的表達量較低(占植

2、物中可溶性蛋白的0.01﹪~0.37﹪)限制了其進一步的開發(fā)利用.由于植物葉綠體表達系統(tǒng)能夠高效表達目的基因、環(huán)境安全性高,已成為目前植物生物反應器研究的熱點之一.在該文中作者將O型口蹄疫病毒VP1抗原基因分別重組和轉(zhuǎn)化到模式植物煙草和衣藻的葉綠體基因組中,并使其得到高效表達,為利用植物葉綠體表達系統(tǒng)生產(chǎn)口蹄疫基因工程疫苗提供了技術依據(jù).論文第二部分主要敘述了煙草葉綠體表達載體PTRVP1的構建,并通過基因槍方法轉(zhuǎn)化煙草葉綠體基因組,獲

3、得了3株具有壯觀霉素抗性的轉(zhuǎn)化再生植株.經(jīng)過兩輪抗生素篩選后,采用FMDV VP1基因的一對引物和煙草葉綠體同源片段的一對引物分別對抗性植株的葉綠體DNA進行的PCR和PCR-Southern blot分析.結果表明目的基因已經(jīng)按設計要求定點整合進入煙草葉綠體基因組中,但是經(jīng)過兩輪抗生素篩選所得的轉(zhuǎn)化植株均為雜合體,要達到同質(zhì)化還需要進一步的抗生素篩選.Western blot和ELISA免疫雜交分析證明FMDV VP1抗原蛋白在煙草葉

4、綠體中得到表達,表達量占可溶性總蛋白量的2﹪~3﹪(1mg可溶性總蛋白含有20~30μg的VP1蛋白).論文第三部分主要敘述了將O型FMDV VP1與強黏膜免疫佐劑霍亂毒素B亞基(CTB)的融合基因克隆重組到衣藻葉綠體表達載體中,并采用基因槍法轉(zhuǎn)化衣藻葉綠體,獲得了具有壯觀霉素抗性的轉(zhuǎn)化子.其中挑取3個抗性轉(zhuǎn)化子進行三輪的抗生素同質(zhì)化篩選.并根據(jù)衣藻葉綠體同源片段chlL基因,設計一對引物對其葉綠體DNA進行的PCR和Southern

5、blot分析.結果表明外源基因已經(jīng)定點整合入衣藻葉綠體基因組的chlL基因中,并且經(jīng)過三輪抗生素篩選所得的衣藻葉綠體轉(zhuǎn)化子中,轉(zhuǎn)基因型葉綠體基因組拷貝占多數(shù).Western blot和ELISA免疫雜交分析表明CTBVP1融合蛋白在衣藻葉綠體中得到表達,表達量占可溶性總蛋白量的3~4﹪(1mg可溶性總蛋白含有30~40μg的重組蛋白).G<,M>-ELISA結合分析證明衣藻葉綠體所表達的CTBVP1融合蛋白能夠正確地折疊,顯示出一定的生