抗EV71病毒VP2單克隆抗體的制備及鑒定.pdf

1、研究背景：
　　 腸道病毒71型（Enterovirus71，EV71）感染可以導(dǎo)致手足口病、皰疹性咽峽炎、無菌性腦脊髓膜炎等多種疾病，并可引起嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥或致死性肺水腫。自1969年首次報(bào)道以來，EV71已經(jīng)在世界范圍內(nèi)引起了十多次暴發(fā)流行，包括澳大利亞、東南亞和歐洲。眾多血清型的腸道病毒在生物表現(xiàn)型與分子構(gòu)成中具有相同的特性，因此其是否存在共同抗原及其位點(diǎn)存在于何處，已引起國內(nèi)外眾多的關(guān)注。衣殼蛋白在病毒感染及誘

2、導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)中起重要作用，國內(nèi)外有許多研究致力于EV71衣殼蛋白及其抗體在基因分型和疫苗研制方面的應(yīng)用。
　　 研究目的：
　　 制備能敏感且特異地識別EV71衣殼蛋白VP2的單克隆抗體，為今后臨床檢測EV71提供物質(zhì)基礎(chǔ)，并為EV71疫苗的制備及基礎(chǔ)研究提供有力保障。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 以GenBank公布的EV71 VP2序列和參考文獻(xiàn)為基礎(chǔ)，利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)，確定并人工合成抗原多肽，并用K

3、eyhole Limpet Hemocyanin（KLH）交聯(lián)以增強(qiáng)多肽的免疫原性。用合成的EV71衣殼蛋白VP2抗原多肽免疫BALB/c小鼠，采用雜交瘤融合技術(shù)和有限稀釋法制備抗EV71 VP2單克隆抗體。將篩選獲得的單抗細(xì)胞株注射BALB/c小鼠腹腔，收獲腹水大量制備單抗，用親和純化法純化抗體。采用ELISA法、免疫細(xì)胞化學(xué)染色法、免疫印跡Western-blot和免疫沉淀法（IP）鑒定單克隆抗體的效價(jià)、反應(yīng)特異性和敏感性。

4、　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 采用雜交瘤技術(shù)，獲得4株針對人工合成的EV71衣殼蛋白VP2抗原多肽的特異性單克隆抗體?？贵w亞類鑒定為IgG1型；用ELISA測定制備的單抗效價(jià)，純化的單抗效價(jià)在1×105～1×106之間；免疫細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定結(jié)果顯示制備的單克隆抗體能夠與EV71衣殼蛋白特異性地結(jié)合。以EV71病毒臨床分離株為抗原，與純化的單克隆抗體進(jìn)行Western-blot和免疫沉淀分析顯示，抗EV71衣殼蛋白VP2單克隆抗體與