細(xì)胞膜表面糖識別芯片制備及其初步應(yīng)用的研究.pdf

1、目的: 糖、蛋白質(zhì)、核酸是涉及生命活動(dòng)本質(zhì)的三類重要生物分子。隨著分子生物學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展，糖的諸多生物功能不斷被認(rèn)識。糖可以以多糖或游離寡糖以及糖復(fù)合物的形式參與許多重要的生命活動(dòng)。此外，還與癌癥、細(xì)菌和病毒感染等疾病有著密切的關(guān)系，有關(guān)糖的研究將成為未來生命科學(xué)的中心研究課題之一。 目前，糖生物學(xué)研究中要解決的關(guān)鍵技術(shù)問題是糖鏈結(jié)構(gòu)分析和合成方法的建立。為此，各國科學(xué)家都致力于糖鏈結(jié)構(gòu)分析和合成方法學(xué)的研究，為糖

2、鏈功能分析提供技術(shù)支持，同時(shí)糖鏈功能研究又集中在細(xì)胞水平上糖鏈的調(diào)控和識別機(jī)制的研究。 凝集素是一類能與糖專一非共價(jià)可逆結(jié)合的蛋白，凝集素的最大特點(diǎn)在于它們能識別糖及其復(fù)合物中復(fù)雜的碳水化合物結(jié)構(gòu)，由于凝集素具有高度的糖結(jié)合專一性，它已經(jīng)成為生物科學(xué)和臨床科學(xué)非常有用的研究工具。目前利用凝集素進(jìn)行細(xì)胞中糖鏈檢測的方法有很多，如凝集素沉淀法、凝集素親和層析法、凝集素親和電泳法、凝集素酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)、凝集素印記法等，上述方法存在一

3、個(gè)共同的缺點(diǎn)：只能對細(xì)胞中提取的糖蛋白進(jìn)行測定，不能直接對細(xì)胞膜上的糖鏈進(jìn)行分析。國外學(xué)者用凝集素芯片只對糖蛋白進(jìn)行檢測，沒有進(jìn)行細(xì)胞的捕獲，需要對糖蛋白進(jìn)行提純，步驟繁瑣，成本昂貴，且不能對細(xì)胞膜表面的糖蛋白進(jìn)行直接的檢測。 本研究旨在利用芯片的高通量性，制備一種能夠檢測糖蛋白上的糖鏈和不同組織來源細(xì)胞膜表面糖鏈特異性的凝集素芯片。由于該芯片能直接進(jìn)行細(xì)胞捕獲，不需要對細(xì)胞膜中的糖蛋白進(jìn)行提取，成本低，操作簡便快捷。通過檢測芯

4、片上凝集素各點(diǎn)陣所捕獲細(xì)胞的熒光強(qiáng)度可以對糖蛋白上的糖鏈進(jìn)行檢測并對細(xì)胞膜表面糖鏈的分布獲得總體的認(rèn)識，因此，凝集素芯片的研制為觀察和檢測細(xì)胞膜表面糖鏈的種類及結(jié)構(gòu)等研究建立了一個(gè)新的技術(shù)平臺。 方法: 1、凝集素芯片的制備分別從芯片載片的不同修飾條件、凝集素在芯片上的固定效果檢驗(yàn)、凝集素芯片捕獲細(xì)胞能力幾個(gè)方面進(jìn)行研究。確定芯片載片的最佳修飾條件、最佳點(diǎn)樣濃度。 2、凝集素芯片的初步應(yīng)用對凝集素芯片檢測不同組織

5、來源的細(xì)胞膜糖鏈特異性進(jìn)行研究，確定凝集素芯片的應(yīng)用價(jià)值。 3、凝集素芯片的檢測分別對凝集素芯片的穩(wěn)定性、敏感性進(jìn)行檢測。 結(jié)果: 1、凝集素芯片的制備實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，凝集素芯片的最佳修飾條件是：硅烷溶液pH=7.2，水化時(shí)間20分鐘，芯片載片經(jīng)醛基修飾，凝集素點(diǎn)樣濃度為1.4mg/ml。 2、凝集素芯片的初步應(yīng)用實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，凝集素芯片可以用于檢測不同組織來源的細(xì)胞膜糖鏈特異性。 3、凝集素芯片的

6、檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，按照上述方法制各的芯片穩(wěn)定性好，敏感度檢測極限為1.8×106個(gè)/ml。 結(jié)論: 本研究制備了一種能夠檢測糖蛋白上的糖鏈和不同組織來源細(xì)胞膜表面糖鏈特異性的凝集素芯片。該芯片穩(wěn)定，重現(xiàn)性高，既具備芯片的高通量性，又避開碳水化合物芯片所面臨的糖立體結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性。同時(shí)，還能直接進(jìn)行細(xì)胞捕獲，不需要對細(xì)胞膜中的糖蛋白進(jìn)行提取，成本低，操作簡便快捷。這為進(jìn)一步研究細(xì)胞膜表面糖鏈結(jié)構(gòu)、分析細(xì)胞免疫、細(xì)胞信號傳遞及