雷米普利對大鼠非梗塞區(qū)心肌膠原及細胞凋亡的影響.pdf

1、心肌梗塞(心梗)后重構包括心肌細胞重構和細胞外間質，尤其是Ⅰ、Ⅲ型膠原的重構。目前國內對非梗塞部位心肌間質纖維化和細胞凋亡的研究以及阻斷RAAS對其影響的研究尚少，且結果仍存在分歧。由于心梗后心臟不同部位、不同階段發(fā)生重構的刺激因素和變化情況可能有所不同，而不同的腎素血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)對心肌組織的親和力也可能不同，雷米普利是一種長效高組織親和力的ACEI，本實驗重點研究梗塞后不同階段非梗塞區(qū)心肌間質膠原及細胞凋亡的變化情

2、況及應用雷米普利干預的結果。 方法： 1.大鼠心梗模型的制備及隨機分組：隨機分為心梗組(100只)、藥物組(100只)及假手術組(50只)。10％水合氯醛0.3ml/100g腹腔內注射麻醉后仰臥固定，胸部備皮。使心臟暴露于胸腔外，距主動脈根部約2-3毫米處穿線，結扎左冠狀動脈前降支。將心臟放回正常位置，同時在切口處放置一膠管并與20ml注射器相連接，至大鼠恢復自主呼吸后縫合皮膚。假手術組只掛線而不結扎冠狀動脈，余同前。

3、 2.實驗動物處死和心臟標本的保存：術后24h、1周、2周及4周隨機從各組中各取10-12只大鼠，經(jīng)股靜脈注入氯化鉀，使心室停搏于舒張期，去除心房、大血管及心臟外結締組織等，留取左心室，稱量左室重量(LVAW)，與體重相除，得出左室相對重量(LVRW)。用直接測量法測量左心室長軸長度(L)。 3.心肌石蠟切片HE染色及梗塞范圍測定：每個大鼠按順序取第二張5μm石蠟切片，常規(guī)HE染色過程染色，在放大10倍下獲取包括整個左室截

4、面的切片圖象，用計算機分析系統(tǒng)測定每張切片上左室截面最長徑(Dmax)、最短徑(Dmin)、瘢痕弧長以及心內、外膜周長，計算左室截面直徑D，球形指數(shù)，梗塞范圍(％)。取梗塞范圍大于20％標本進入研究隊列。 4.透射電鏡標本制備：取凍存的心肌組織約1 mm3，2.5％戊二醛固定2小時，PBS沖洗3次，1％0.04(鋨酸)固定2小時，PBS沖洗后經(jīng)系列酒精、丙酮脫水，Epon-812環(huán)氧樹脂包埋，35℃、45℃、60℃加熱聚合。IX

5、B-V(NOVA)型超薄切片機切片，醋酸雙氧鈾檸檬酸鉛重金屬染色，H-600-TEM透射電鏡觀察和拍照實驗結果。 5.原位末端標記(TUNEL)法標記凋亡心肌細胞：每一標本取三個不同部位石蠟切片，常規(guī)脫臘入水。置樣品于濕盒中，37℃標記2小時。0.01 MTBS洗2分鐘×3次后加封閉液50μL/片，室溫30分鐘，甩掉封閉液，不洗。用抗體稀釋液1:100稀釋生物素化抗地高辛抗體(取1ml抗體稀釋液加生物素化抗地高辛抗體10μL)，

6、混勻后50μL/片加至標本上。 6.心肌膠原容積密度分數(shù)(CVF)測定：切片脫蠟后蒸餾水洗。半定量分析：每張Messon染色切片在放大400倍下從非梗塞區(qū)獲取切片圖象，隨機選取4個視野，通過測量選定區(qū)域染色組織的面積，將測量的面積與觀察下的整個面積的比例來作為每個視野中膠原組織占百分比。富含膠原的血管邊界區(qū)域不包括在測量范圍內。 7.TNF-α、MMP-α及caspase-3免疫組織化學染色(SP法)：石蠟切片常規(guī)脫蠟至

7、水。陽性反應產物強度灰度值測定：每個大鼠取一張切片，在放大400倍獲取非梗塞區(qū)切片圖象，每張切片隨機選取4個視野，各組免疫組織化學陽性反應產物強度用圖像分析系統(tǒng)灰度值表示，取均數(shù)代表其表達強度。 8.AngⅡ及ALd含量檢測：稱取左室非梗塞區(qū)心肌100mg剪碎，加入AngⅡ試劑盒中緩沖液0.6ml，在冰浴中進行超聲勻漿，勻漿液在4℃下以3000rpm離心20分鐘，取上清液原液及稀釋10倍后液體，分別測定ALd及AngⅡ含量。

8、 9.逆轉錄多聚酶鏈反應(RT-PCR.)測定Ⅰ、Ⅲ型膠原和凋亡基因Bcl-2及p53的mRNA表達：采用Trizol一步法提取心肌標本中的總RNA，按RT-PCR試劑盒步驟完成逆轉錄PCR反應。 10.統(tǒng)計學處理：所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(-x±s)表示，數(shù)據(jù)應用SPSS 11.5軟件進行差異顯著性檢驗，P<0.05有統(tǒng)計學意義。 結果: 1.大鼠一般情況：術后存活的149只大鼠，在隨后4周的干預期內共死亡2

9、2只，死亡率14.8％。其中24小時內死亡15只；術后1周死亡6只；術后2周死亡1只。最終假手術組存活47只，心梗組存活32只，藥物組存活37只。 2.心肌組織病理學改變：經(jīng)左冠狀動脈永久性結扎后形成左室前壁透壁性心肌梗塞，梗塞范圍為23-35％。心肌組織24h HE染色顯示梗塞區(qū)心肌纖維溶解斷裂，細胞淡染，可見大量白細胞浸潤；假手術組表現(xiàn)為心肌細胞排列整齊，無炎性細胞浸潤。 3.左室形態(tài)結構改變：以左室絕對重量(LVA

10、W)、左室相對重量(IVRW)、左室截面直徑和球形指數(shù)代表左室重塑指標。三組比較，術后24h，LVAW、LVRW、左室截面直徑和球形指數(shù)尚元統(tǒng)計學差異(P>0.05)；手術1W后，心梗組與假手術組比較，LVAW、LVRW、左室截面直徑增大，球形指數(shù)縮小，2W-4W最明顯，組間有顯著統(tǒng)計學意義(p<0.05～0.001)，用雷米普利2W后，上述指標有所改善，4W明顯改善(p<0.05)。 4.非梗塞區(qū)心肌CVF的變化：心肌組織Me

11、sson染色顯示，假手術組間質只可見散在亮綠色膠原；術后24h-1W，心梗組和藥物組間質亮綠色膠原與假手術組基本相似；2W時心梗組間質亮綠色膠原增多；4W時心梗組間質亮綠色膠原明顯增多，而藥物組問質亮綠色膠原明顯減少。 5.非梗塞區(qū)心肌細胞的凋亡：TUNEL染色可見，假手術組大鼠及術后24h心梗組和藥物組大鼠非梗塞區(qū)未見凋亡心肌細胞；術后lW～4W心梗組和藥物組大鼠心肌組織均分布有TUNEL染色陽性心肌細胞，核呈棕黃色，染色深淺

12、不一，核大小不一。 6.非梗塞區(qū)心肌超微結構：透射電鏡可見假手術組心肌細胞核膜完整，核質分布均勻，染色較淡，呈細粒分散狀，胞漿內線粒體膜完整，嵴清楚；術后2W～4W心梗組及藥物組有的心肌細胞核收縮，染色質縮合成塊狀，有的線粒體輕度腫脹、部分空泡化。術后2W～4W時心梗組心肌間質成纖維細胞增多，間質膠原紆維明顯增多；術后4W時藥物組心肌間質膠原纖維明顯減少。 7.非梗塞區(qū)心肌TNF-α的變化：假手術組心肌間質只有散在染色極

13、淺的弱陽性反應。術后1W-4W，心梗組心肌間質可見明顯TNF-α表達。術后2w-4w，藥物組TNF-α表達略少于心梗組。 8.非梗塞區(qū)心肌MMP-9的變化：術后24h-4W，心梗組和藥物組MMP-9表達與假手術組比較均無增強。灰度值分析顯示，術后24h-1w2組MMP-9水平與假手術組比較無差異，而術后2w-4W雖然有下降趨勢，但也無統(tǒng)計學意義(p>0.05)。 9.非梗塞區(qū)心肌caspase-3的變化：假手術組可見散在

14、分布的心肌細胞，其胞漿具有染成棕黃色的caspase-3產物。術后24h-1W，心梗組和藥物組具有caspase-3陽性染色產物的心肌細胞與假手術組相似，免疫組織化學染色灰度值與假手術組無統(tǒng)計學差異(p>0.05)；術后2W-4W，2組具有caspase-3陽性染色產物的心肌細胞數(shù)量增多，顏色增濃，免疫組織化學染色灰度值明顯降低，與假手術組比較有統(tǒng)計學意義(p<0.05)，但藥物組與心梗組間無差異。 10.非梗塞區(qū)心肌AngⅡ及

15、ALD的變化：術后24h，除了心梗組AngⅡ水平略有升高外，各組AngⅡ及ALD水平相似(p>0.05)；術后1W-4W，與假手術組比較，心梗組AngⅡ水平逐漸升高(p<0.05-0.001)，術后2W，心梗組ALD也開始明顯升高(p<0.05～0.001)；用藥后2W時AngⅡ明顯回落(p<0.05)，但繼續(xù)用藥至4w時，AngⅡ水平仍然很高，且與心梗組比較沒有回降(p>0.05)，而ALD水平明顯低于心梗組(p<0.05)，但仍高于

16、假手術組(p<0.05)。 11.非梗塞區(qū)心?、?、Ⅲ型膠原(col-1、col-3)的變化：以β-actin為內參對照，結果以Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原mRNA與β-actin mRNA灰度值的比值表示。結果顯示，術后24h，三組間Ⅰ、Ⅲ型膠原含量相似；術后1W～4W，心梗組col-3均明顯高于假手術組(p<0.05)，但4w時略有下降趨勢，而用藥后1W～4W均未見明顯下降(P>0.05)；術后2W-4W，心梗組col-1明顯上升，4W

17、更明顯(p<0.05～0.01)，用藥4W時col-1明顯回降(p<0.05)，但仍高于假手術組(p<0.05)o12.非梗塞區(qū)心肌凋亡基因p53及Bcl-2的變化：以β-actin為內參對照，結果以p53及Bcl-2 mRNA與β-actin mRNA灰度值的比值表示。 結論： 1.大鼠心肌梗塞后1周即發(fā)生了左室重構，早期持續(xù)使用雷米普利對左室重構有逆轉作用。 2.大鼠心梗2周后非梗塞區(qū)出現(xiàn)間質纖維化，可能與局