1型糖尿病大鼠心肌膠原代謝的變化及苯那普利對(duì)間質(zhì)重塑的干預(yù)研究.pdf

1、目的： 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)建立1型糖尿病動(dòng)物模型，檢測(cè)血清PIIINP、心?、笮湍z原(collagen type Ⅲ，Ⅲ-C)蛋白表達(dá)以及心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction，CVF)的變化，從多個(gè)角度觀察糖尿病大鼠不同時(shí)期心肌間質(zhì)膠原代謝的情況，同時(shí)從基因表達(dá)、蛋白及生物學(xué)活性三個(gè)水平檢測(cè)大鼠血液和心肌MMP-2、TIMP-2，分析其相關(guān)關(guān)系，探討MMPs/T

2、IMPs在糖尿病心肌間質(zhì)重塑過(guò)程中的作用，進(jìn)一步研究糖尿病心肌病變的可能發(fā)病機(jī)制。近來(lái)研究證實(shí)腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)在糖尿病心血管病變發(fā)展中起著重要作用，通過(guò)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(angiotensin-con Verting enzyme inhibitor，ACEI)抑制RAS可有效延緩糖尿病心血管病變發(fā)展。苯那普利即是目前常用的一種ACEI類藥物，它競(jìng)爭(zhēng)性抑制血管緊張素轉(zhuǎn)

3、換酶(angiotensin-conVerting enzyme，ACE)的活性而減少血管緊張素II(angiotensin，AngII)，從而阻斷由RAS激活所介導(dǎo)的一系列連鎖反應(yīng)。然而有關(guān)RAS在糖尿病心肌病ECM重塑中的作用以及與MMPs/TIMPs之間的關(guān)系卻罕見(jiàn)研究報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)在STZ誘導(dǎo)建立1型糖尿病動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，從病理形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)水平觀察苯那普利對(duì)心肌膠原代謝、MMP-2/TIMP-2系統(tǒng)的影響，探討苯那普

4、利在糖尿病心肌病間質(zhì)重塑中的作用。 研究方法： 1.建立IDDM大鼠模型及分組：選用6～8周齡雄性Wistar大鼠46只，體重200～250g，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(16只)和糖尿病組(30只)。糖尿病模型以一次性腹腔注射60m/kg STZ誘發(fā)，注射72h后取尾靜脈血檢測(cè)血糖≥16.7mmol/L、尿糖+++以上者表示造模成功，成功率為100％。將正常對(duì)照組大鼠按體重隨機(jī)再分為4周組(NC4W)和12周組(NC12W)，

5、每組8只；糖尿病大鼠隨機(jī)分為三組：糖尿病4周組(DM4W)，糖尿病12周組(DM12W)和糖尿病苯那普利干預(yù)組(DB12W)，每組lO只。DB12w組予苯那普利10mg·kg-1·d-1灌胃，持續(xù)12周，NC組和DM組灌予等量自來(lái)水。DM4W、DM12W和DB12W組各取8只進(jìn)行取材和檢測(cè)。 2.血清PIIINP水平：放射免疫法檢測(cè)。 3.血清MMP-2、TIMP-2含量：酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linkedim

6、munosorbent assay，ELISA)定量檢測(cè)。 4.心肌組織的形態(tài)學(xué)檢測(cè)：(1)Van Gieson(VG)染色：觀察心肌間質(zhì)膠原含量的變化，并測(cè)量CVF進(jìn)行半定量分析；(2)透射電鏡鈾-鉛雙重染色：觀察心肌超微結(jié)構(gòu)的改變。 5.心肌組織MMP-2活性：明膠酶譜分析法檢測(cè)。 6.心肌組織MMP-2、TIMP-2、III-C的蛋白表達(dá)：免疫組化方法檢測(cè)。 7.心肌組織中MMP-2、TIMP-2m

7、RNA表達(dá)：逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reversetranscription-polymerase chain reaction，RT-PCR)方法測(cè)定。 研究結(jié)果： 1.血糖、心重、體重及心臟重量指數(shù)的變化：與同期正常對(duì)照組相比較，糖尿病大鼠在病程第4周和第12周時(shí)血糖水平明顯升高，心重、體重顯著下降，心臟重量指數(shù)升高。隨著病程的延長(zhǎng)，糖尿病大鼠心重、體重逐漸下降，但心重/體重逐漸升高。ACEI干預(yù)治療對(duì)上述指標(biāo)影響不明

8、顯。 2.心肌超微結(jié)構(gòu)的改變：正常對(duì)照組大鼠心肌肌原纖維豐富，肌絲排列緊密整齊；線粒體嵴多、排列有序。糖尿病大鼠4周時(shí)肌原纖維呈灶性變性、斷裂、溶解，排列紊亂，線粒體數(shù)目增多；12周時(shí)肌節(jié)對(duì)位不齊，線粒體增多腫脹，有斷嵴、空泡樣變性現(xiàn)象，間質(zhì)纖維增生，糖原顆粒增多。苯那普利治療組大鼠心肌病理改變明顯減輕。 3.膠原代謝的變化： (1)心肌膠原分布的改變：正常大鼠心肌細(xì)胞之間和血管周圍僅見(jiàn)少許紅染的膠原組織，糖尿病

9、組心肌細(xì)胞間及血管周圍膠原分布明顯增多，CVF顯著升高；隨病程延長(zhǎng)，糖尿病大鼠心肌間質(zhì)纖維化愈加明顯，CVF隨之相應(yīng)增加。苯那普利治療后心肌纖維化程度明顯改善，CVF同步下降。 (2)心肌III-C蛋白表達(dá)的變化：與同期正常對(duì)照組相比，糖尿病大鼠心肌III-C分布明顯增多，且隨病程延長(zhǎng)而加重；ACEI干預(yù)后顯著減少，但仍高于正常。 (3)血清PIIINP水平的變化：病程4周時(shí)糖尿病大鼠血清PIIINP明顯高于同期正常對(duì)照

10、組，12周時(shí)這一變化進(jìn)一步加劇，經(jīng)苯那普利治療后顯著降低。相關(guān)分析顯示血清PIIINT與心肌CVF、III-C均呈顯著正相關(guān)關(guān)系。 4.血清MMP-2、TIMP-2水平的變化：與同期正常對(duì)照組相比，糖尿病大鼠病程4周時(shí)血清MMP-2有增高趨勢(shì)，但差異尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，12周時(shí)則明顯升高；糖尿病組血清TIMP-2在病程4周和12周時(shí)均顯著高于同期正常對(duì)照組。 5.心肌MMP-2活性的改變：糖尿病大鼠心肌組織MMP-2活性表達(dá)在病程4

11、周和12周時(shí)均明顯低于同期正常對(duì)照組，且隨著病程的延長(zhǎng)持續(xù)減弱；苯那普利干預(yù)后MMP-2活性輕度升高，但差異尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 6.心肌MMP-2、TIMP-2蛋白及mRNA表達(dá)的變化：與同期正常對(duì)照組相比，糖尿病大鼠在病程4周和12周時(shí)心肌組織MMP-2基因和蛋白表達(dá)均明顯減弱：TIMP-2 mRNA表達(dá)均顯著升高；TIMP-2蛋白表達(dá)在病程4周時(shí)有升高趨勢(shì)，但與正常組的差異尚不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，至12周時(shí)則顯著增強(qiáng)。ACEI干預(yù)后

12、，糖尿病大鼠心肌MMP-2 mRNA和蛋自表達(dá)明顯上升，TIMP-2基因和蛋白表達(dá)均顯著下降。 7.相關(guān)分析顯示，血清MMP-2與心肌MMP-2活性、基因表達(dá)負(fù)相關(guān)，與MMP.2蛋白表達(dá)無(wú)相關(guān)關(guān)系，與血清PIIINP、心肌CVF、III-C蛋白表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系；血清。TIMP-2與心肌CVF、III-C蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，但與血清PIIINP、心肌TIMP-2基因和蛋白表達(dá)無(wú)相關(guān)關(guān)系。 8. 相關(guān)分析顯示，心肌CVF、II

13、I-C蛋白表達(dá)均與MMP-2活性、mRNA和蛋白表達(dá)呈高度負(fù)相關(guān)，與TIMP-2基因、蛋白表達(dá)呈明顯正相關(guān)關(guān)系。 研究結(jié)論： 1.糖尿病大鼠在病程早期己出現(xiàn)心肌重塑，表現(xiàn)為心臟重量指數(shù)升高、心肌細(xì)胞增生肥大和變性壞死、心肌間質(zhì)膠原纖維化明顯，并隨病程延長(zhǎng)加重。 2.糖尿病大鼠在病程早期即出現(xiàn)血清PIIINP水平顯著升高，心肌III-C蛋白表達(dá)增多，心肌膠原容積分?jǐn)?shù)升高等心肌膠原代謝紊亂表現(xiàn)，進(jìn)而心肌膠原網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)受

14、到破壞，膠原代謝增強(qiáng)并過(guò)度沉積，形成心肌纖維化。 3.糖尿病大鼠血清PIIINP水平的升高與心肌膠原含量和III-C蛋白表達(dá)的增加相一致，提示血清PIIINP可以用于預(yù)測(cè)糖尿病大鼠心肌間質(zhì)纖維化的程度，作為糖尿病心肌病變的無(wú)創(chuàng)檢測(cè)指標(biāo)之一。 4.糖尿病大鼠在病程早期即開始有心肌MMP-2mRNA和蛋白表達(dá)、活性的明顯降低，TIMP-2mRNA和蛋白表達(dá)的增強(qiáng)，并且相關(guān)分析顯示心肌CVF、III-C與MMP-2和TIMP-

15、2的表達(dá)密切相關(guān)，提示心肌MMP-2/TIMP-2比例下降導(dǎo)致膠原降解減少，出現(xiàn)膠原沉積，進(jìn)而造成心肌間質(zhì)重塑。 5.血清MMP-2和TIMP-2水平與心肌CVF、III-C蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，提示血清MMP-2和TIMP-2均可作為心肌膠原合成或纖維化程度的預(yù)測(cè)指標(biāo)，有助于糖尿病心肌病的早期發(fā)現(xiàn)。 6.ACEI類藥物苯那普利干預(yù)不僅可使糖尿病大鼠心肌細(xì)胞病變減輕，還可使血清PIIINP水平、心肌間質(zhì)膠原含量以及III-C蛋白表達(dá)

16、下降，減少間質(zhì)膠原的聚積，減輕心肌纖維化程度。提示ACEI類藥物可同時(shí)干預(yù)心肌實(shí)質(zhì)和間質(zhì)重塑。 7.應(yīng)用ACEI類藥物干預(yù)可使糖尿病大鼠心肌MMP-2表達(dá)上調(diào)和TIMP-2表達(dá)下調(diào)，改善MMP-2/TIMP-2系統(tǒng)的失衡，促進(jìn)心肌膠原的降解，減輕心肌間質(zhì)膠原沉積，延緩心肌間質(zhì)重塑的進(jìn)展。 創(chuàng)新和意義： 1.本研究應(yīng)用STZ誘導(dǎo)建立1型糖尿病組大鼠模型，從多角度、多水平觀察其心肌膠原代謝變化及其與MMP-2/TIM

17、P-2系統(tǒng)的關(guān)系，進(jìn)一步揭示了MMPs/TIMPs在糖尿病心肌間質(zhì)重塑過(guò)程中的作用，為以MMPs為治療靶點(diǎn)的新藥在糖尿病心肌病中的應(yīng)用提供了有力的理論依據(jù)。 2.首次在同一動(dòng)物個(gè)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)血清PIIINP、MMP-2、TIMP-2與心肌膠原含量密切相關(guān)，提出上述指標(biāo)可用于預(yù)測(cè)糖尿病患者心肌間質(zhì)纖維化的程度，作為糖尿病心肌病變的無(wú)創(chuàng)檢測(cè)指標(biāo)，有助于糖尿病心肌病的早期發(fā)現(xiàn)。 3.本研究應(yīng)用苯那普利干預(yù)治療，觀察其對(duì)于糖尿病大鼠