茶樹中三個與茶尺蠖取食誘導(dǎo)相關(guān)的肉桂醇脫氫酶(CAD)基因克隆與功能分析.pdf

1、木質(zhì)素是由多種簡單的苯丙烷及其衍生物聚合形成的復(fù)雜聚合物，其通過有效物理化學(xué)屏障在植物抵抗病、蟲害侵入中起著重要作用。而肉桂醇脫氫酶(CAD)是控制木質(zhì)素生物合成途徑的關(guān)鍵酶之一，然而茶樹體內(nèi) CAD基因相關(guān)研究及其與抗蟲性之間的關(guān)系研究至今未見報道。本論文主要對茶樹葉片中的三個與茶尺蠖取食誘導(dǎo)相關(guān)的 CAD基因進(jìn)行了 cDNA克隆，鑒定和表達(dá)特征分析。主要結(jié)果如下：
　　 1．基于本課題組建立的茶樹被茶尺蠖取食誘導(dǎo)前后的 cD

2、NA消減雜交文庫（SSH）和茶樹全器官轉(zhuǎn)錄組庫獲得的 3 條與 CAD基因同源性很高的 EST序列，利用 RACE 技術(shù)分別克隆了編碼 CAD基因的全長 cDNA序列，其中 1條來自于SSH 編碼的CAD 命名為CAD2，2 條來自于轉(zhuǎn)錄組庫編碼的CAD分別命名為CAD1和CAD3。CAD2基因全長為 1574bp，開放閱讀框972bp，編碼 324個氨基酸；CAD1基因全長為 1386bp，開放閱讀框 1146bp，編碼 382個氨基

3、酸； CAD3 全長為1350bp，開放閱讀框1083bp，編碼361個氨基酸。
　　 并將三個基因的序列遞交到 GenBank，登錄號分別為 HM440158、HQ880207和HQ880208。
　　 2．多序列同源比對和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測分析表明，CAD1和 CAD3 之間同源性為54％，而兩者與CAD2 同源性比較低，僅為20％。只有CAD1和CAD3含有二者共有的3個保守的功能結(jié)構(gòu)域：Zn1 結(jié)合位點[GHE(X)

4、2(X)5G(X)2V]，Zn2 結(jié)合位點 [GD(X)9.10C(X)2C(X)2C(X)7C]和 NADPH 輔酶結(jié)合位點[GXG(X)2G]；僅 CAD2 含有依賴于 NADPH的表異構(gòu)酶/脫水酶家族的氧化還原酶功能結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，CAD1、CAD2和 CAD3分屬于 3個不同的家族。
　　 3．原核表達(dá)結(jié)果表明，CAD2基因表達(dá)的蛋白大部分是分布于上清的可溶性蛋白，分子量為53 kD，而 CAD1和CAD3基

5、因表達(dá)的蛋白皆形成包涵體，分子量分別為59 kD與56 kD。酶活測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三個CAD基因表達(dá)的蛋白質(zhì)具有不同的催化活性，其中以CAD2 活性最高，為0.43μmol·min 1·mg 1，CAD3 次之，為4.2nmol·min 1·mg 1，CAD1 最小，為3.8nmol·min 1·mg 1。CAD2的最適pH 為6，最適溫度為30℃，酶動力學(xué)參數(shù)Km 為1.974μmol·L 1，Vmax 為1.7437μmol·min

6、1·mg 1。
　　 4．利用Southern blot 技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，茶樹基因組中的CAD1和CAD2基因均以雙拷貝存在，而CAD3基因則是以單拷貝形式存在。
　　 5．茶尺蠖取食誘導(dǎo)3個CAD基因的表達(dá)量不盡相同，其中CAD1和CAD2間的誘導(dǎo)表達(dá)量的最大值差異不大，但是二者各自與CAD3的差別要明顯大于CAD1和CAD2 間的差異；三個基因的誘導(dǎo)表達(dá)量皆存在品種間差異，總體表現(xiàn)為舒茶早大于龍井43；從誘導(dǎo)表達(dá)規(guī)律上

7、來說，三個基因也存在差異，CAD1和CAD2表達(dá)量均是隨著取食后時間增加而緩慢增加，最大值分別出現(xiàn)在24 h和912h之間，而CAD3是先急劇增加至最大值，緊接著急劇下降，最大值則出現(xiàn)在36h 之間。而單獨的機(jī)械損傷處理后，三個基因間的最大表達(dá)量差異與茶尺蠖取食誘導(dǎo)的類似，但是品種間差異不顯著。通過外源激素誘導(dǎo)試驗發(fā)現(xiàn)，茉莉酸甲酯（MeJA）、水楊酸（SA）和脫落酸(ABA)處理均能誘導(dǎo) 3個 CAD基因的表達(dá)上調(diào)，但是三者各自的最大表