Δ-15脫氫酶基因克隆、表達及其活性分析.pdf

1、多不飽和脂肪酸(polyunsaturate fatty acids,PUFAs)是人體必需的營養(yǎng)物質,對人體有至關重要的作用,一旦缺少就會導致各種疾病的發(fā)生,所以在營養(yǎng)及醫(yī)藥方面具有很重要的作用。α-亞麻酸(α-linolenic acid,ALA)屬于ω-3系列PUFAs,是合成二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)與二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)的前體,在維持人正常生

2、理功能中起著至關重要的作用。萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)與單胞藻(Monodus subterraneus)是高產(chǎn)ω-3類PUFAs的兩種微藻,ω-3類PUFAs生物合成途徑中含有ALA合成的關鍵-Δ-15脂肪酸脫氫酶。本文以萊茵衣藻(C.reinhardtii)和擬南芥(Arabidopsis thaliana)為材料,從中分別克隆了△-15脂肪酸脫氫酶全長基因,分別轉化酵母和煙草,并進行了表達和生物

3、學功能分析；同時完成了單胞藻的轉錄組測序和生物信息學分析,主要結果如下；
　　 分別提取擬南芥嫩葉與萊茵衣藻對數(shù)期細胞的總RNA,經(jīng)純化后,采用RT-PCR方法擴增得到的片段與pMD19-T載體連接后,轉化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞,經(jīng)過PCR鑒定、樣品測序、Blast分析,分別確定為萊茵衣藻的△-15脫氫酶基因(全長為1362 bp,編碼419個氨基酸)和擬南芥的△-15脫氫酶基因(全長為1525 bp,編碼447個氨基酸)。

4、
　　 把這兩種△-15脂肪酸脫氫酶基因分別插入畢赤酵母胞內(nèi)表達載體pPIC3.5K中,電擊轉入畢赤酵母GS115菌株中,利用甲醇誘導畢赤酵母表達,經(jīng)過RT-PCR檢測、甲酯化畢赤酵母總脂肪酸并進行氣相色譜分析,結果表明萊茵衣藻和擬南芥的△-15脂肪酸脫氫酶基因在畢赤酵母中均得到了表達,與轉空載體的菌株相比,轉△-15脂肪酸脫氫酶基因的菌株的亞油酸摩爾含量由44.3％下降至26.9％,同時ALA的摩爾含量相比轉空載體的也有所提高

5、,驗證了△-15脂肪酸脫氫酶基因在體內(nèi)的生物學功能,進而說明萊茵衣藻△-15脂肪酸脫氫酶是在亞油酸的距甲基端的第十五個碳原子處脫氫的,從而生成ALA。同時把兩種△-15脂肪酸脫氫酶基因連接入植物表達載體pCAMBIA2300中,電擊轉化入根癌農(nóng)桿菌LBA4404中。用含△-15脂肪酸脫氫酶基因的根癌農(nóng)桿菌菌液侵染煙草葉盤,50 mg／L卡那霉素篩選出抗性芽,抗性芽生根。PCR檢測△-15脂肪酸脫氫酶基因已經(jīng)整合入煙草基因組中,RT-PC

6、R檢測表明△-15脂肪酸脫氫酶基因在煙草能夠正常轉錄。
　　 為克隆PLIFAs合成途徑相關的高效新基因,對富含EPA的單胞藻(M.subterraneus)UTEX＃B151的轉錄組測序并且進行分析。序列經(jīng)拼接得到26,903條ESTs,序列長度大于500 bp的有10,792條,經(jīng)Blastx分析得到17,232個獨立基因。在此基礎上,Blastx分析數(shù)據(jù)庫為KEGG,有5,270個獨立基因與各種代謝途徑能夠匹配上,得到了3