Δ-15脫氫酶基因克隆、表達(dá)及其活性分析.pdf

1、多不飽和脂肪酸(polyunsaturate fatty acids,PUFAs)是人體必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),對(duì)人體有至關(guān)重要的作用,一旦缺少就會(huì)導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生,所以在營(yíng)養(yǎng)及醫(yī)藥方面具有很重要的作用。α-亞麻酸(α-linolenic acid,ALA)屬于ω-3系列PUFAs,是合成二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)與二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)的前體,在維持人正常生

2、理功能中起著至關(guān)重要的作用。萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)與單胞藻(Monodus subterraneus)是高產(chǎn)ω-3類PUFAs的兩種微藻,ω-3類PUFAs生物合成途徑中含有ALA合成的關(guān)鍵-Δ-15脂肪酸脫氫酶。本文以萊茵衣藻(C.reinhardtii)和擬南芥(Arabidopsis thaliana)為材料,從中分別克隆了△-15脂肪酸脫氫酶全長(zhǎng)基因,分別轉(zhuǎn)化酵母和煙草,并進(jìn)行了表達(dá)和生物

3、學(xué)功能分析；同時(shí)完成了單胞藻的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和生物信息學(xué)分析,主要結(jié)果如下；
　　 分別提取擬南芥嫩葉與萊茵衣藻對(duì)數(shù)期細(xì)胞的總RNA,經(jīng)純化后,采用RT-PCR方法擴(kuò)增得到的片段與pMD19-T載體連接后,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)過(guò)PCR鑒定、樣品測(cè)序、Blast分析,分別確定為萊茵衣藻的△-15脫氫酶基因(全長(zhǎng)為1362 bp,編碼419個(gè)氨基酸)和擬南芥的△-15脫氫酶基因(全長(zhǎng)為1525 bp,編碼447個(gè)氨基酸)。

4、
　　 把這兩種△-15脂肪酸脫氫酶基因分別插入畢赤酵母胞內(nèi)表達(dá)載體pPIC3.5K中,電擊轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115菌株中,利用甲醇誘導(dǎo)畢赤酵母表達(dá),經(jīng)過(guò)RT-PCR檢測(cè)、甲酯化畢赤酵母總脂肪酸并進(jìn)行氣相色譜分析,結(jié)果表明萊茵衣藻和擬南芥的△-15脂肪酸脫氫酶基因在畢赤酵母中均得到了表達(dá),與轉(zhuǎn)空載體的菌株相比,轉(zhuǎn)△-15脂肪酸脫氫酶基因的菌株的亞油酸摩爾含量由44.3％下降至26.9％,同時(shí)ALA的摩爾含量相比轉(zhuǎn)空載體的也有所提高

5、,驗(yàn)證了△-15脂肪酸脫氫酶基因在體內(nèi)的生物學(xué)功能,進(jìn)而說(shuō)明萊茵衣藻△-15脂肪酸脫氫酶是在亞油酸的距甲基端的第十五個(gè)碳原子處脫氫的,從而生成ALA。同時(shí)把兩種△-15脂肪酸脫氫酶基因連接入植物表達(dá)載體pCAMBIA2300中,電擊轉(zhuǎn)化入根癌農(nóng)桿菌LBA4404中。用含△-15脂肪酸脫氫酶基因的根癌農(nóng)桿菌菌液侵染煙草葉盤,50 mg／L卡那霉素篩選出抗性芽,抗性芽生根。PCR檢測(cè)△-15脂肪酸脫氫酶基因已經(jīng)整合入煙草基因組中,RT-PC

6、R檢測(cè)表明△-15脂肪酸脫氫酶基因在煙草能夠正常轉(zhuǎn)錄。
　　 為克隆PLIFAs合成途徑相關(guān)的高效新基因,對(duì)富含EPA的單胞藻(M.subterraneus)UTEX＃B151的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序并且進(jìn)行分析。序列經(jīng)拼接得到26,903條ESTs,序列長(zhǎng)度大于500 bp的有10,792條,經(jīng)Blastx分析得到17,232個(gè)獨(dú)立基因。在此基礎(chǔ)上,Blastx分析數(shù)據(jù)庫(kù)為KEGG,有5,270個(gè)獨(dú)立基因與各種代謝途徑能夠匹配上,得到了3