基于SSH技術(shù)研究茶樹被茶尺蠖取食誘導(dǎo)的基因差異表達(dá).pdf

1、茶樹蟲害一直是我國茶葉生產(chǎn)中優(yōu)質(zhì)和高效的主要限制因子,而茶樹對(duì)害蟲取食后所誘發(fā)的防御反應(yīng)分子機(jī)制至今不清;同時(shí)常綠木本植物對(duì)害蟲取食誘導(dǎo)防御的分子機(jī)理研究相當(dāng)缺乏。本論文利用抑制性消減雜交(SSH)技術(shù),在茶樹葉片被主要害蟲-茶尺蠖取食后,對(duì)茶葉中誘導(dǎo)表達(dá)的基因進(jìn)行了篩選和研究,在此基礎(chǔ)上通過熒光定量PCR技術(shù),比較研究了與重要防御功能相關(guān)的差異表達(dá)片段(TDF)的表達(dá)特征和在不同品種間的表達(dá)變化差異。主要結(jié)果如下:
　　 (1

2、)建立了穩(wěn)定可靠的SSH技術(shù)體系,為后續(xù)研究不同樣本之間的基因差異表達(dá)提供了技術(shù)保障。
　　 (2)通過對(duì)正向差減文庫中包含的誘導(dǎo)表達(dá)cDNA片段進(jìn)行克隆鑒定,并對(duì)長度大于200bp的片段進(jìn)行測序,最終獲得了280個(gè)TDF的序列。按照長度大小進(jìn)行分類:長度在200bp-400bp之間的TDF有151個(gè),占總量的54％;長度在400bp-600bp之間的TDF有101個(gè),占總量的36％;長度大于600bp的TDF有28個(gè),占總量的

3、10％;通過Blastx比對(duì)顯示:與已知功能基因序列具有較高同源性的的TDF有157個(gè),占總量的56％:為推測蛋白的克隆子有19個(gè),占總量的6％;沒有任何匹配的有104個(gè),占總量的37％。并已將其中的271個(gè)TDF序列登錄在GenBank中(GW342615-GW342885)。
　　 (3)對(duì)其中144個(gè)誘導(dǎo)表達(dá)基因的推測功能進(jìn)行分類得出的結(jié)果表明:可能與蛋白質(zhì)代謝相關(guān)的基因有31個(gè),占總體的21％;與光合作用和初級(jí)代謝功能相

4、關(guān)的有18個(gè),占總體的13％;與轉(zhuǎn)運(yùn)類蛋白功能相關(guān)的有11個(gè),占總體的8％;與轉(zhuǎn)錄功能相關(guān)的有12個(gè),占總體的8％;與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能相關(guān)的有11個(gè),占總體的8％;與脂類代謝和次級(jí)代謝功能相關(guān)的分別有7個(gè)和13個(gè),分別占總體的5％和9％;與逆境與防御功能相關(guān)的有22個(gè),占總量的15％;與植物體其他代謝途徑相關(guān)的有19個(gè),占總量的13％。(4)依據(jù)現(xiàn)有相關(guān)植物對(duì)害蟲防御機(jī)制的報(bào)道分析得出茶樹被茶尺蠖取食誘導(dǎo)可能所涉及的防御途徑:與直接防御相關(guān)

5、的有4個(gè)TDF,分別涉及咖啡堿合成酶(TDF-55、88)、黃酮醇合成酶(TDF-72、146)、精氨酸酶(TDF-2)和半胱氨酸酶抑制劑(TDF-144);與間接防御相關(guān)的有7個(gè)TDF,分別涉及綠葉性揮發(fā)物、芳香族揮發(fā)物和萜烯類揮發(fā)物生物很成相關(guān)。
　　 (5)通過定量PCR對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)基因的表達(dá)量的分析,我們發(fā)現(xiàn)茶樹受到茶尺蠖取食危害后,與不同防御機(jī)制相關(guān)的TDF上調(diào)表達(dá)量是不同的,且其隨著時(shí)間的變化規(guī)律和在不同品種間表達(dá)量也

6、存在差異。例如咖啡堿合成酶(TDF-55、88)和黃酮合成酶(TDF-72、146)受茶尺蠖取食后不同的時(shí)間里,二者都隨著時(shí)間的增加而出現(xiàn)增加的現(xiàn)象,但是咖啡堿合成酶在取食后4小時(shí)增加的幅度明顯比黃酮合成酶大。不同茶樹品種被茶尺蠖取食誘導(dǎo)后,其誘導(dǎo)的差異片段的上調(diào)表達(dá)量也有不同。例如其中龍井43被取食后,TDF-73上調(diào)表達(dá)倍數(shù)比舒茶早高出最多,達(dá)到74.5％,TDF-55和TDF-139次之,分別比舒茶早高出57.8％和57.1％,T