基于內(nèi)外源脅迫誘導(dǎo)的Bacillus subtilis過(guò)氧化氫酶發(fā)酵優(yōu)化和發(fā)酵過(guò)程放大.pdf

1、過(guò)氧化氫酶(CAT)高效催化H2O2分解為H2O和O2。微生物過(guò)氧化氫酶因其廣泛的來(lái)源和優(yōu)良的性質(zhì)越來(lái)越受到研究者的青睞。部分微生物產(chǎn)過(guò)氧化氫酶已實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上微生物過(guò)氧化氫酶正逐步取代牛肝過(guò)氧化氫酶，具有很好的市場(chǎng)前景。國(guó)內(nèi)前期研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)現(xiàn)過(guò)氧化氫酶工業(yè)化生產(chǎn)的最主要問(wèn)題是要解決總酶活偏低，發(fā)酵液中酶含量較少這兩大問(wèn)題。本文以一株高產(chǎn)過(guò)CAT的Bacillus subtilis WSHDZ-01為研究菌株，研究?jī)?nèi)外源脅迫

2、下Bacillus subtilis WSHDZ-01的發(fā)酵過(guò)程及在工業(yè)化中的實(shí)際應(yīng)用。主要的研究?jī)?nèi)容與結(jié)果如下：
　　 ⑴通過(guò)研究比較后選定最優(yōu)內(nèi)源脅迫物為乙醇:在發(fā)酵0h添加2.0%(v/v)的乙醇時(shí)，與未添加的對(duì)照組比較，CAT總酶活和胞內(nèi)酶活分別提高了126%和150%。乙醇不同的添加方式對(duì)菌體產(chǎn)酶的促進(jìn)程度也不一樣，為了最大程度地促進(jìn)Bacillus sp.WSHDZ-01產(chǎn)酶，考察了乙醇不同的添加方式，發(fā)現(xiàn):在0 h

3、、12 h、36 h分別添加2.0%(v/v)的乙醇，發(fā)酵結(jié)束時(shí)CAT酶活達(dá)到了15000 U/mL，較對(duì)照6450 U/mL提高了132.6%，這說(shuō)明多次乙醇脅迫更能有效地促進(jìn)CAT的過(guò)量合成?；诙啻畏峙砑右掖己笠掖嫉南乃俾剩O(shè)計(jì)了分階段恒速流加乙醇的發(fā)酵策略進(jìn)一步提高乙醇的產(chǎn)量，CAT總酶活(28990 U/mL)和胞內(nèi)酶活(9691 U/mL)均達(dá)到最大值，發(fā)酵周期縮短為42 h，實(shí)現(xiàn)了CAT的高酶活(28990U/mL)和

4、高生產(chǎn)強(qiáng)度(470 U/(mL·h))的統(tǒng)一，為過(guò)氧化氫酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
　　 ⑵表面活性劑不能促進(jìn)Bacillus sp.WSHDZ-01合成CAT，而添加外源脅迫物H2O2能脅迫菌體產(chǎn)酶并促進(jìn)酶的分泌。即，在發(fā)酵12 h添加0.3%(V/v)H2O2可使發(fā)酵液中CAT水平提高43.5%。在耐受范圍內(nèi)，H2O2少量多次添加能更好促進(jìn)菌體產(chǎn)酶:在12 h和24 h分兩次添加0.15%的H2O2時(shí)，總酶活可達(dá)9744U/

5、mL，比對(duì)照提高了51%。當(dāng)乙醇和H2O2同時(shí)脅迫Bacillus sp.WSHDZ-01時(shí)，胞外酶比總酶活的比例達(dá)82.5%為高效提取CAT奠定基礎(chǔ)。
　　 ⑶經(jīng)過(guò)放大計(jì)算和實(shí)際經(jīng)驗(yàn)確定攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量和罐壓后，采用分批添加乙醇的方法脅迫菌體產(chǎn)酶。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵罐體積放大到30 L后菌體生長(zhǎng)優(yōu)于在3L罐中的生長(zhǎng)，但是產(chǎn)酶時(shí)間延后，CAT酶活在發(fā)酵54 h時(shí)達(dá)到最大值34700 U/mL，CAT的生產(chǎn)強(qiáng)度為643 U/mL/h。

6、在1噸發(fā)酵罐中，為保證發(fā)酵前期發(fā)酵液中的溶氧，攪拌轉(zhuǎn)速前期160 r/min，后期100 r/min，采用通風(fēng)量0.2-0，4vvm。細(xì)胞干重在54 h達(dá)到最大值3.2 g/L，CAT酶活在發(fā)酵64 h時(shí)達(dá)到最大值18240 U/mL，CAT的生產(chǎn)強(qiáng)度為285 U/mL/h。胞內(nèi)酶活在54 h后達(dá)到穩(wěn)定9000U/mL，胞外酶活在60 h后超過(guò)胞內(nèi)酶活最大可達(dá)10036 U/mL。在5噸發(fā)酵罐中，采用通風(fēng)量0.4 vvm，攪拌轉(zhuǎn)速100