藤黃微球菌過氧化氫酶發(fā)酵條件優(yōu)化、誘變育種及其基因的克隆、表達(dá)與純化.pdf

1、目的：對藤黃微球菌(Micrococcus luteus)過氧化氫酶(catalase A，CAT)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化catalase A的產(chǎn)酶條件。對Mluteus進(jìn)行物理誘變和化學(xué)誘變，篩選catalase A正誘變菌株。擴增Mluteus catalase A基因，構(gòu)建pProExHTa-CAT重組子，實現(xiàn)catalase A在大腸桿菌中的高效表達(dá)，通過金屬離子親和層析法純化表達(dá)蛋白，并對純化后蛋白的性質(zhì)進(jìn)行初步研究，為后續(xù)探

2、討Mluteus IFO3064的抗過氧化氫氧化機制和抗氧化酶防御體系以及對重組CAT的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 本研究分為五個部分：
　　 1.初步對藤黃微球菌Mluteus IFO3064過氧化氫酶發(fā)酵條件優(yōu)化，提高過氧化氫酶catalase A的產(chǎn)酶條件和酶活。
　　 2.通過紫外誘變、NTG誘變，篩選酶活提高的正誘變菌株。
　　 3.藤黃微球菌過氧化氫酶基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建

3、：用PCR方法自M.luteus ACCC41016基因組中擴增catalase A目的片段，并將該基因亞克隆至克隆載體pMD18-T中，利用氨芐青霉素抗性篩選陽性克隆。用EcoRⅠ+HindⅢ雙酶切驗證和基因序列測定鑒定pMD18-CAT重組子。該克隆質(zhì)粒EcoRⅠ+HindⅢ雙酶切后，回收含CAT基因的酶切產(chǎn)物，與同樣雙酶切后回收的pProEx-HTa質(zhì)粒片段連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pProExHTa-CAT，再雙酶切驗證和基因序列測

4、定鑒定pProExHTa-CAT重組子。
　　 4.過氧化氫酶融合蛋白的表達(dá)及純化：pProExHTa-CAT重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至宿主菌DH5a，IPTG誘導(dǎo)CAT融合蛋白表達(dá)，SDS-PAGE分析目的蛋白表達(dá)情況；通過Ni2+-NTA柱子離子親和層析對CAT融合蛋白進(jìn)行純化，SDS-PAGE檢測蛋白純度和亞基分子量。
　　 5.過氧化氫酶融合蛋白的性質(zhì)研究：包括純化產(chǎn)物總蛋白含量測定，CAT活性測定，CAT的pH穩(wěn)定性、溫度

5、穩(wěn)定性研究。
　　 結(jié)果：
　　 1.初步優(yōu)化M.luteus IFO3064 Catalase A發(fā)酵條件：牛肉膏2g/dL，MgCl20.25 g/dL，蛋白胨1g/dL，pH6.5，發(fā)酵時間44h。
　　 2．通過對Mluteus IFO3064進(jìn)行紫外誘變和化學(xué)誘變，篩選到三株正誘變菌株，其酶活可提高2～3倍。
　　 3．成功構(gòu)建M luteus catalase A原核克隆重組質(zhì)粒pMD18-C

6、AT。此質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ+HindⅢ雙酶切后，得到克隆載體片段(2.7kb)和目的基因片段(1.5kb)；經(jīng)測序，目的基因全長1518bp，與GenBank所公布的序列相比較，存在三個堿基的差異，同源性可達(dá)99.8％。再將雙酶切的CAT片段和酶切的表達(dá)質(zhì)粒連接，成功構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pProExHTa-CAT，此質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后，得到表達(dá)載體片段(4.7kb)和目的基因片段(1.5kb)；經(jīng)測序，目的基因全長1509bp，與GenBank所

7、公布的序列相比較，存在六個堿基的差異，同源性為99.6％；融合蛋白編碼序列全長1509bp，編碼含503個氨基酸殘基的多肽鏈，與GenBank所公布的序列相比較，存在兩個氨基酸的差異，同源性為99.6％。
　　 4．經(jīng)1mMIPTG誘導(dǎo)，含pProExHTa-CAT的表達(dá)宿主菌DH5a在60.3kD處有明顯的表達(dá)條帶，與核酸序列測定所推導(dǎo)預(yù)計的CAT融合蛋白分子量相符。通過鎳金屬離子親和層析對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，可得到電泳純的CA

8、T融合蛋白。
　　 5．純化產(chǎn)物經(jīng)證實為過氧化氫酶，活性可達(dá)166U/(mg．protein)，其活性在pH5～8、溫度25～50℃范圍內(nèi)較為穩(wěn)定。
　　 結(jié)論：初步優(yōu)化了M.luteus catalase A的發(fā)酵條件；篩選到誘變后酶活提高的正誘變菌株；成功構(gòu)建了原核表達(dá)重組質(zhì)粒pProExHTa-CAT，實現(xiàn)了Mluteus的catalase A基因在原核細(xì)胞中的高效表達(dá)。通過金屬離子親和層析可以簡便、快速地得到電泳