立氏立克次體主要表面蛋白鑒定及其免疫保護(hù)性研究.pdf

1、立氏立克次體(Rickettsia rickettsii)是一種嚴(yán)格胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性菌，為落基山斑點(diǎn)熱(Rocky Mountain Spotted Fever, RMSF)的病原體。RMSF在自然界主要通過蜱叮咬而傳播，在人為情況下可以通過氣溶膠傳播。RMSF臨床表現(xiàn)主要是急性發(fā)熱、頭疼、肌肉酸痛和皮疹，如果治療不及時(shí)出現(xiàn)急性肺水腫、腎衰竭、腦炎等嚴(yán)重癥狀而死亡。疫苗的免疫接種是預(yù)防人立氏立克次體自然感染和人為感染的最有效手段。<

2、br>　　目前，滅活立氏立克次體疫苗的免疫保護(hù)效果不理想。立氏立克次體作為一種專性胞內(nèi)寄生菌，其表面蛋白能夠介導(dǎo)立克次體入侵血管內(nèi)皮細(xì)胞（宿主細(xì)胞）、宿主細(xì)胞間遷移、宿主免疫系統(tǒng)激活等，在立克次體感染的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要的角色。因此，鑒定立氏立克次體保護(hù)性表面蛋白抗原并用其構(gòu)建亞單位疫苗是近幾十年來RMSF疫苗的主要發(fā)展方向。本研究通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法分離鑒定立氏立克次體主要的細(xì)胞表面蛋白，通過動(dòng)物免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)篩選保護(hù)性表面蛋白抗原，

3、通過體液免疫和細(xì)胞免疫分析探討保護(hù)性抗原的免疫保護(hù)機(jī)制。
　　首先，采用生物素標(biāo)記立氏立克次體表面蛋白，通過鏈親和素親和層析和雙向電泳分離出己標(biāo)記的細(xì)胞表面蛋白，隨后用電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)這些表面蛋白進(jìn)行鑒定。結(jié)果共鑒定出10個(gè)主要表面蛋白，其中5個(gè)蛋白(OmpA、OmpB、 GroEL、GroES、DNA-bing protein)已有報(bào)道，另外5個(gè)蛋白(Adr1、Adr2、OmpW、Porin_4、TolC)為新鑒定的立氏立克次體

4、細(xì)胞表面蛋白。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，5個(gè)新表面蛋白均含有β折疊和信號(hào)肽，為多次跨膜蛋白;間接免疫熒光和透射免疫電鏡進(jìn)一步證實(shí)5種新表面蛋白可存在于細(xì)胞內(nèi)膜和/或外膜。將5個(gè)新表面蛋白基因克隆和原核表達(dá)，研制出5個(gè)重組蛋白(rAdrl、rAdr2、rOmpW、rPorin_4、rTolC)。用這5個(gè)重組蛋白分別免疫小鼠制備免疫血清，血清中和實(shí)驗(yàn)揭示rAdr1、rAdr2、rOmpW免疫血清能夠顯著地抑制立克次體入侵宿主細(xì)胞，提示這3個(gè)蛋白均

5、能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平中和抗體。將5個(gè)重組蛋白分別免疫小鼠，用立氏立克次體毒株攻擊后顯示rAdr1、rAdr2、rOmpW、rPorin_4等重組蛋白免疫小鼠的肺臟立克次體載量和病理損傷顯著地低于和輕于非免疫小鼠，特別是rAdr2免疫小鼠的肝臟、脾臟和肺臟中立克次體的載量都明顯地低于非免疫小鼠，證明Adr1、Adr2、OmpW和Porin_4是立氏立克次體的保護(hù)性抗原，特別是Adr2是一個(gè)重要保護(hù)性抗原。
　　在前期黑龍江立克次體

6、的研究中發(fā)現(xiàn)重組蛋白rYbgF具有很好的免疫保護(hù)性，蛋白序列比對(duì)顯示立氏立克次體和黑龍江立克次體的YbgF蛋白245個(gè)氨基酸序列中僅有6個(gè)氨基酸的差異，提示該蛋白為斑點(diǎn)熱群立克次體的保守抗原。透射免疫電鏡觀察確認(rèn)YbgF蛋白在立氏立克次體外膜和內(nèi)膜上呈多點(diǎn)分布。血清學(xué)中和試驗(yàn)證明rYbgF免疫血清能夠顯著抑制立克次體對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的入侵，提示YbgF在介導(dǎo)立克次體入侵血管內(nèi)皮細(xì)胞過程中起重要作用。此外，小鼠免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)rYbgF免疫

7、組小鼠的肝臟、脾臟和肺臟中立克次體的載量及病理學(xué)損傷程度明顯地低于和輕于非免疫小鼠，證明YbgF也是立氏立克次體的重要保護(hù)性抗原。
　　為了進(jìn)一步闡明rAdr2和rYbgF的免疫保護(hù)機(jī)理，將其分別免疫小鼠，用ELISA檢測首次免疫后第14、28、42、56天血清IgG、IgG1和IgG2a的效價(jià)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高水平特異性IgG、IgG1和IgG2a，特別是IgG2a與IgG1的比值隨免疫時(shí)相而逐漸上升，說明兩者

8、均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性IgG2a為主的Th1型體液免疫反應(yīng)。在體外用rAdr2、rYbgF分別刺激立氏立克次體感染小鼠的CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rAdr2和rYbgF均能誘導(dǎo)立克次體抗原致敏的CD4+和CD8+T細(xì)胞顯著增殖并分泌高水平的IFN-γ和TNF-α，證明rAdr2和rYbgF均能夠有效誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答。
　　許多研究已經(jīng)證明OmpB為立克次體的主要保護(hù)性抗原。本研究根據(jù)基因編碼蛋白抗原性和親水性等

9、將立氏立克次體完整的ompB基因(4965bp)分成5個(gè)片段并在大腸埃希菌細(xì)胞內(nèi)分別表達(dá)，制備5個(gè)重組蛋白(rOmpB-1～rOmpB-5)。免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)顯示這5個(gè)重組蛋白均能誘導(dǎo)小鼠對(duì)抗立氏立克次體感染，其中rOmpB-4的免疫保護(hù)效果最好。將rOmpB-4與rAdr2聯(lián)合免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合免疫小鼠的免疫保護(hù)效能顯著好于rAdr2和rOmpB-4的單獨(dú)免疫。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)rOmpB-4與rAdr2聯(lián)合疫苗能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生顯著增強(qiáng)的Th

10、1型特異性免疫應(yīng)答，即抗原特異性T細(xì)胞產(chǎn)生更高水平IFN-γ和TNF-α及B細(xì)胞產(chǎn)生更高水平特異性IgG2a。
　　貝氏柯克斯體（Coxiella burnetii）是一種隸屬于軍團(tuán)菌目、類似于立克次體的胞內(nèi)寄生茵，為Q熱的病原體，與立氏立克次體一同被列入生物戰(zhàn)劑。先前的研究表明貝氏柯克斯體氯仿甲醇提取殘留物（chloroform-methanol residue of C.burnetii，CMR-C）是一種潛在的免疫增強(qiáng)劑。本

11、研究將CMR-C與立氏立克次體rOmpB-4混合免疫小鼠，立氏立克次體攻毒結(jié)果顯示混合免疫小鼠臟器中立氏立克次體的載量顯著低于rOmpB-4單獨(dú)免疫小鼠，證明CMR-C能夠顯著增強(qiáng)rOmpB-4特異性免疫保護(hù)效能。另外，用貝氏柯克斯體攻擊聯(lián)合免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠脾臟柯克斯體載量顯著低于rOmpB-4單獨(dú)免疫小鼠，證明該聯(lián)合免疫具有抗立氏立克次體和貝氏柯克斯體的雙重免疫保護(hù)效能。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該聯(lián)合免疫小鼠能夠產(chǎn)生高水平的抗細(xì)胞內(nèi)寄生菌關(guān)鍵

12、細(xì)胞因子IFN-γ和TNF-α。
　　綜上所述，本研究共發(fā)現(xiàn)了立氏立克次體5個(gè)新的細(xì)胞表面蛋白(Adr1、Adr2、OmpW、Porin_4、TolC)，其定位于立克次體外膜和/或內(nèi)膜;研究還證明Adr2和YbgF為立氏立克次體主要保護(hù)性抗原，另外證明立氏立克次體外膜蛋白B片段rOmpB-4與rAdr2聯(lián)合免疫的特異性保護(hù)效能顯著強(qiáng)于其單獨(dú)免疫，以及CMR-C能夠顯著增強(qiáng)rAdr2的特異性免疫保護(hù)效能。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這些有效和增強(qiáng)

13、的特異性免疫保護(hù)主要依賴于它們誘導(dǎo)產(chǎn)生的Th1特異性免疫應(yīng)答，包括激活抗原特異性CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生和分泌高水平IFN-γ和TNF-α，以及激活B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生分泌高水平特異性IgG2a。在這些特異性免疫因子的協(xié)同作用下，機(jī)體能有效或更有效地殺傷和清除血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)寄生的立氏立克次體。本研究為落基山斑點(diǎn)熱亞單位疫苗的研發(fā)提供新的候選抗原分子，同時(shí)也為研究立氏立克次體致病機(jī)制揭示了潛在致病分子。另外，CMR-C與rOmpB-4聯(lián)