淋病奈瑟菌表面蛋白A和孔蛋白B免疫保護(hù)性研究.pdf

1、淋病是由淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)感染引起的一種常見性傳播疾病(Sexual Dansmitted Disease，STD)，主要引起男性的急性尿道炎、前列腺炎、附睪炎；在女性主要表現(xiàn)為隱性感染，常因不能及時(shí)醫(yī)治而導(dǎo)致病菌向深部擴(kuò)散，引起盆腔炎、子宮內(nèi)膜炎、輸卵管炎，并能導(dǎo)致不孕癥。淋病發(fā)病率高，是當(dāng)前性病防治中的重點(diǎn)。由于淋病奈瑟菌容易對抗生素產(chǎn)生耐藥性，給淋病的治療帶來了新的問題，因而加強(qiáng)疫苗研究對淋病

2、防制工作具有重要意義。 淋病奈瑟菌疫苗研制歷經(jīng)艱難，二十世紀(jì)七十年代全細(xì)胞疫苗的人體試驗(yàn)遭遇失敗，研究的重點(diǎn)開始轉(zhuǎn)向亞單位疫苗和基因疫苗等新型疫苗。菌毛是第一個(gè)被純化的淋病奈瑟菌亞單位成分，盡管純化后的菌毛能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生較高滴度的抗體，但是由于菌毛表面一些表位變異程度高，這些抗體并不具有顯著的免疫保護(hù)作用。同樣由于高度變異的原因，另一類重要粘附因子Opa蛋白在淋病疫苗研制中也受到了限制。 奈瑟菌表面蛋白A(Neisse

3、ria surface protein A，NspA)表達(dá)于所有淋病奈瑟菌菌株，高度保守，免疫原性強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究表明，重組真核表達(dá)載體pCNspA免疫小鼠產(chǎn)生了具有介導(dǎo)補(bǔ)體溶解淋病奈瑟菌作用的NspA特異性抗體?？椎鞍?Porin)是淋病奈瑟菌的重要外膜蛋白，但是從菌體中純化孔蛋白極易污染Rmp蛋白，而Rmp蛋白的抗體能夠阻遏孔蛋白抗體的抗菌作用。高度純化的孔蛋白可以刺激動(dòng)物產(chǎn)生高滴度的保護(hù)性抗體。 本研究進(jìn)一步探索了N

4、spA和孔蛋白B(Porin B，PorB)在淋病疫苗研制中的應(yīng)用前景。為了改進(jìn)基因免疫效價(jià)不高的缺陷，在基因免疫后用重組蛋白進(jìn)行加強(qiáng)免疫。構(gòu)建了NspA原核表達(dá)載體pQE31NspA。SDS-PAGE和Western-blotting檢測表明pQE31NspA可在大腸桿菌中高效表達(dá)重組蛋白NspA。rNspA經(jīng)Ni+-NTAPurification System純化，并通過透析復(fù)性。然后用本室前期構(gòu)建的NspA真核表達(dá)載體pCNspA

5、基因免疫BALB/c小鼠。4次基因免疫后在小鼠血清中僅能檢測到1:200的NspA特異性IgG。用rNspA加強(qiáng)免疫1次后，NspA特異性IgG則提高到1:3200以上。但是仍然略低于完全以rNspA免疫小鼠血清中特異性抗體的效價(jià)。抗體介導(dǎo)的補(bǔ)體溶淋病奈瑟菌實(shí)驗(yàn)和抗體調(diào)理吞噬實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩種方案獲得的免疫血清均表現(xiàn)出良好的抗淋病奈瑟菌作用；然而，免疫保護(hù)作用的強(qiáng)弱并不是與血清中特異性IgG水平相對應(yīng)，抗體水平略低的基因免疫蛋白加強(qiáng)組血

6、清表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗菌作用。為了避免Rmp蛋白的污染和提高基因免疫的效果，從Christopher博士惠贈(zèng)的PorB原核表達(dá)載體pUNCH682中切出PorB基因，構(gòu)建了PorB真核表達(dá)載體pcDNA3.1PorB，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞后，經(jīng)Western-blotting驗(yàn)證，該重組載體可以在COS-1細(xì)胞中表達(dá)PorB。大量提取pcDNA3.1PorB，4次基因免疫BALB/c小鼠后誘生的淋病奈瑟菌特異性抗體效價(jià)較低，僅為1:200。

7、用原核表達(dá)的rPorB加強(qiáng)免疫一次后抗體水平可大幅度提高，可達(dá)1:3200以上。完全以PorB蛋白免疫小鼠能誘生出更高的特異性抗體水平。但是在免疫血清免疫保護(hù)性方面，兩種免疫方案獲得的血清均表現(xiàn)出良好的抗菌活性和調(diào)理吞噬作用；完全以PorB蛋白免疫的小鼠血清免疫保護(hù)作用略低。 為了研究NspA和PorB的免疫保護(hù)作用是否具有協(xié)同性，將二者進(jìn)行聯(lián)合免疫。實(shí)驗(yàn)小鼠分為2組，一是rNspA和rPorB蛋白免疫組，二是先以基因免疫然后用

8、重組蛋白加強(qiáng)組。每組小鼠接種的免疫原總含量不變，其中兩種免疫原各占一半。ELISA檢測結(jié)果表明蛋白免疫獲得的血清IgG水平略高，但兩種免疫方案均產(chǎn)生了較高水平的血清IgG，且兩種抗原聯(lián)合免疫后的血清IgG的水平比原來單個(gè)抗原免疫的血清lgG水平要高出許多：抗體介導(dǎo)的補(bǔ)體溶菌實(shí)驗(yàn)和調(diào)理吞噬實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，聯(lián)合免疫血清的淋病奈瑟菌特異性抗菌活性高于單一抗原免疫血清。提示兩種抗原之間確實(shí)存在一定的協(xié)同作用。此外，先基因免疫后蛋白加強(qiáng)組小鼠血清