淋病奈瑟菌表面蛋白A和孔蛋白B免疫保護性研究.pdf

1、淋病是由淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)感染引起的一種常見性傳播疾病(Sexual Dansmitted Disease，STD)，主要引起男性的急性尿道炎、前列腺炎、附睪炎；在女性主要表現(xiàn)為隱性感染，常因不能及時醫(yī)治而導致病菌向深部擴散，引起盆腔炎、子宮內膜炎、輸卵管炎，并能導致不孕癥。淋病發(fā)病率高，是當前性病防治中的重點。由于淋病奈瑟菌容易對抗生素產生耐藥性，給淋病的治療帶來了新的問題，因而加強疫苗研究對淋病

2、防制工作具有重要意義。 淋病奈瑟菌疫苗研制歷經艱難，二十世紀七十年代全細胞疫苗的人體試驗遭遇失敗，研究的重點開始轉向亞單位疫苗和基因疫苗等新型疫苗。菌毛是第一個被純化的淋病奈瑟菌亞單位成分，盡管純化后的菌毛能夠刺激機體產生較高滴度的抗體，但是由于菌毛表面一些表位變異程度高，這些抗體并不具有顯著的免疫保護作用。同樣由于高度變異的原因，另一類重要粘附因子Opa蛋白在淋病疫苗研制中也受到了限制。 奈瑟菌表面蛋白A(Neisse

3、ria surface protein A，NspA)表達于所有淋病奈瑟菌菌株，高度保守，免疫原性強。本實驗室的前期研究表明，重組真核表達載體pCNspA免疫小鼠產生了具有介導補體溶解淋病奈瑟菌作用的NspA特異性抗體。孔蛋白(Porin)是淋病奈瑟菌的重要外膜蛋白，但是從菌體中純化孔蛋白極易污染Rmp蛋白，而Rmp蛋白的抗體能夠阻遏孔蛋白抗體的抗菌作用。高度純化的孔蛋白可以刺激動物產生高滴度的保護性抗體。 本研究進一步探索了N

4、spA和孔蛋白B(Porin B，PorB)在淋病疫苗研制中的應用前景。為了改進基因免疫效價不高的缺陷，在基因免疫后用重組蛋白進行加強免疫。構建了NspA原核表達載體pQE31NspA。SDS-PAGE和Western-blotting檢測表明pQE31NspA可在大腸桿菌中高效表達重組蛋白NspA。rNspA經Ni+-NTAPurification System純化，并通過透析復性。然后用本室前期構建的NspA真核表達載體pCNspA

5、基因免疫BALB/c小鼠。4次基因免疫后在小鼠血清中僅能檢測到1:200的NspA特異性IgG。用rNspA加強免疫1次后，NspA特異性IgG則提高到1:3200以上。但是仍然略低于完全以rNspA免疫小鼠血清中特異性抗體的效價?？贵w介導的補體溶淋病奈瑟菌實驗和抗體調理吞噬實驗結果表明，兩種方案獲得的免疫血清均表現(xiàn)出良好的抗淋病奈瑟菌作用；然而，免疫保護作用的強弱并不是與血清中特異性IgG水平相對應，抗體水平略低的基因免疫蛋白加強組血

6、清表現(xiàn)出更強的抗菌作用。為了避免Rmp蛋白的污染和提高基因免疫的效果，從Christopher博士惠贈的PorB原核表達載體pUNCH682中切出PorB基因，構建了PorB真核表達載體pcDNA3.1PorB，瞬時轉染COS-1細胞后，經Western-blotting驗證，該重組載體可以在COS-1細胞中表達PorB。大量提取pcDNA3.1PorB，4次基因免疫BALB/c小鼠后誘生的淋病奈瑟菌特異性抗體效價較低，僅為1:200。

7、用原核表達的rPorB加強免疫一次后抗體水平可大幅度提高，可達1:3200以上。完全以PorB蛋白免疫小鼠能誘生出更高的特異性抗體水平。但是在免疫血清免疫保護性方面，兩種免疫方案獲得的血清均表現(xiàn)出良好的抗菌活性和調理吞噬作用；完全以PorB蛋白免疫的小鼠血清免疫保護作用略低。 為了研究NspA和PorB的免疫保護作用是否具有協(xié)同性，將二者進行聯(lián)合免疫。實驗小鼠分為2組，一是rNspA和rPorB蛋白免疫組，二是先以基因免疫然后用

8、重組蛋白加強組。每組小鼠接種的免疫原總含量不變，其中兩種免疫原各占一半。ELISA檢測結果表明蛋白免疫獲得的血清IgG水平略高，但兩種免疫方案均產生了較高水平的血清IgG，且兩種抗原聯(lián)合免疫后的血清IgG的水平比原來單個抗原免疫的血清lgG水平要高出許多：抗體介導的補體溶菌實驗和調理吞噬實驗結果均表明，聯(lián)合免疫血清的淋病奈瑟菌特異性抗菌活性高于單一抗原免疫血清。提示兩種抗原之間確實存在一定的協(xié)同作用。此外，先基因免疫后蛋白加強組小鼠血清