立氏立克次體外膜蛋白B基因的應(yīng)用研究.pdf

1、立氏立克次體(Rickettsia rickettsii)是落基山斑點(diǎn)熱(Rocky Mountain SpottedFever，RMSF)的病原體，為專性細(xì)胞內(nèi)寄生的小革蘭氏陰性菌，人對其十分易感。外膜蛋白B(rOmpB)是立氏立克次體最主要的表面蛋白抗原，被認(rèn)為是發(fā)展落基山斑點(diǎn)熱診斷試劑和亞單位疫苗的靶分子。 本研究首先依據(jù)立氏立克次體ompB基因序列設(shè)計(jì)特異性引物和探針，以克隆的ompB基因片段為DNA模板，在ABI 79

2、00型熒光定量PCR檢測儀上建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法。建立的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線Ct值與模板拷貝數(shù)呈良好線性關(guān)系，最低檢測濃度為5拷貝/μl，與普通PCR相比較，敏感性是普通PCR的100倍；用該方法檢測其它相關(guān)立克次體和常見非立克次體病原菌，檢出結(jié)果均為陰性。用該熒光定量PCR方法檢測立氏立克次體感染的豚鼠血液標(biāo)本、小鼠脾臟標(biāo)本及細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)本，檢測的結(jié)果與立氏立克次體感染進(jìn)程相關(guān)。表明本研究建立的檢測立氏立克次體實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法具

3、有高特異性和高敏感性，適用于定量檢測各種樣本中的立氏立克次體和立氏立克次體感染早期的實(shí)驗(yàn)室診斷。 本研究還克隆表達(dá)了rOmpB的主要抗原片段-120kDa表面蛋白，并對重組蛋白的免疫原性和抗原性進(jìn)行了研究。利用抗原表位預(yù)測技術(shù)，將120kDa蛋白分為抗原表位比較集中的六段蛋白，通過優(yōu)化條件，利用不含胰化蛋白胨的新型MDG培養(yǎng)基實(shí)現(xiàn)了120kDa蛋白和六個(gè)蛋白片段在大腸桿菌的表達(dá)。免疫印跡分析證明重組蛋白中僅120kDa重組蛋白和

4、5號蛋白(P5)能與立氏立克次體免疫血清特異反應(yīng)。 用純化的七個(gè)重組蛋白免疫小鼠，IFA檢測表明120kDa和P5蛋白能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高水平的特異性：IgG抗體。對免疫小鼠的脾臟做體外淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)120kDa蛋白和P5蛋白能誘導(dǎo)較高水平的淋巴細(xì)胞增殖。采用RT-PCR方法檢測免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞被不同蛋白抗原刺激后的細(xì)胞因子表達(dá)，發(fā)現(xiàn)120kDa蛋白和P5蛋白刺激的小鼠脾淋巴細(xì)胞均表達(dá)了IFN-γ、IL-2、IL-4和I

5、L-10。結(jié)果證明120kDa，蛋白和P5蛋白均能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，具有良好的免疫原性。對重組蛋白免疫的小鼠進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，攻毒試驗(yàn)后小鼠主要臟器內(nèi)病原體載量的定量檢測結(jié)果表明，120kDa和P5重組蛋白組與滅活全菌抗原組之間沒有顯著性的差別，顯示了良好的免疫保護(hù)性。 120kDa蛋白和P5蛋白可與立克次體屬的多種立克次體免疫血清發(fā)生交叉反應(yīng)，與貝氏柯克斯體、恙蟲病東方體不反應(yīng)，提示這兩種蛋白具有