蛋白芯片法在檢測念珠菌、曲霉優(yōu)勢抗體中的應(yīng)用.pdf

1、隨著器官、骨髓和干細胞移植的大量開展，惡性腫瘤病人發(fā)病人數(shù)增加和生存期延長導(dǎo)致免疫功能低下患者的數(shù)量不斷增加，廣譜抗菌藥物、免疫抑制劑等的廣泛使用，導(dǎo)管留置操作的普及，以及因嚴重疾病和大手術(shù)住在重癥監(jiān)護病房時間延長，使得侵襲性真菌感染(Invasivefungalinfections，IFI)的發(fā)病率不斷升高。由于缺乏特異性臨床特征，血液真菌分離培養(yǎng)敏感性很低，IFI的病原學(xué)診斷十分困難。因此，迫切需要研究建立快速、簡便，敏感性強、特異

2、性高的非培養(yǎng)診斷方法來改善侵襲性真菌感染的病原學(xué)診斷。
　　 研究目的：
　　 利用本實驗室前期研究中篩選并制備的與念珠菌和曲霉侵襲性感染相關(guān)的三種重組蛋白，建立低密度蛋白質(zhì)芯片法，檢測臨床病人血清標(biāo)本中相應(yīng)的特異性抗體;評估該方法對侵襲性念珠菌病(IC)和侵襲性曲霉?。↖A）診斷價值。
　　 研究方法：
　　 純化白念珠菌烯醇化酶(Eno)、果糖二磷酸醛縮酶(Fba1)和煙曲霉硫氧還蛋白還原酶(TR)三

3、種重組蛋白。分別對點樣緩沖液、抗原固定條件和封閉方式進行優(yōu)化;同時對Eno，F(xiàn)ba1和TR三種真菌抗原的點陣濃度和待測血清稀釋度進行優(yōu)化，確定其最佳的反應(yīng)條件。建立檢測念珠菌、曲霉優(yōu)勢抗體的蛋白芯片，并對該方法的特異性、重復(fù)性和穩(wěn)定性等方面進行考察。收集各類IC患者及IA患者血清，以定植感染者、細菌血癥患者、其他真菌感染者及健康體檢者血清為對照，用蛋白芯片法測定血清中的相應(yīng)抗體，確定cut-off值，評估該法在侵襲性念珠菌病(IC)和侵

4、襲性曲霉病(IA)診斷中的應(yīng)用價值。
　　 研究結(jié)果：
　　 (1)以硝酸纖維素膜為固相載體，對點樣緩沖液、抗原固定條件和封閉方式進行優(yōu)化，確定以Tris-HC(l)緩沖液(pH8.5)為點樣緩沖液、37℃濕盒孵育2h、5％脫脂奶粉封閉1h為最佳反應(yīng)條件。在此基礎(chǔ)上對Eno，F(xiàn)ba1和TR三種真菌抗原的點陣濃度和血清稀釋度進行優(yōu)化，最后確定:Eno、Fba1、TR點樣濃度依次為0.5mg/mL、0.04mg/mL、1.0

5、mg/mL，待測血清稀釋度為1∶10。
　　 (2)在研究結(jié)果(1)的基礎(chǔ)上，建立檢測念珠菌、曲霉優(yōu)勢抗體的蛋白芯片，對其進行方法學(xué)考核，結(jié)果顯示該方法特異性及重復(fù)性良好，將該芯片置于4℃保存，75d內(nèi)用于檢測，檢測結(jié)果未見明顯變化。
　　 (3)以建立的蛋白芯片法測定IC、IA患者血清中的相應(yīng)抗體，以66.5、29.5、58.5作為抗Eno、抗Fba1、抗TR的cut-off值，結(jié)果抗Eno抗體和抗Fba1抗體對診斷I

6、C的敏感性和特異性分別為67.6％(71/105)和96.5％(299/310),64.8％(68/105)和90.3％(280/310)。通過聯(lián)合檢測抗Eno抗體和抗Fba1抗體，可將敏感性提高至81％?？筎R抗體對診斷IA的敏感性為71.4％(31/42)，特異性為98.2％(5/285)。
　　 結(jié)論：
　　 成功制備了檢測念珠菌、曲霉優(yōu)勢抗體的蛋白芯片，在此基礎(chǔ)上建立了檢測患者血清中抗Eno抗體、抗Fba1抗體及