應(yīng)用蛋白芯片篩選急性髓系白血病血清標(biāo)志物的研究.pdf

1、目的：
　　近年來(lái)細(xì)胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)及治療靶點(diǎn)識(shí)別技術(shù)的發(fā)展,推動(dòng)了靶向治療及分層治療水平的進(jìn)步,明顯提高了急性髓系白血病(acutemyeloidleukemia,AML)臨床療效及總體生存率。目前細(xì)胞遺傳學(xué)和分子基因檢測(cè)已成為AML臨床分型的主要依據(jù)。美國(guó)國(guó)立癌癥綜合網(wǎng)(NCCN)和中國(guó)AML(非APL)診療指南均依據(jù)細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)指標(biāo)對(duì)AML進(jìn)行危險(xiǎn)度分級(jí),分為預(yù)后良好,預(yù)后中等和預(yù)后不良組。但許多預(yù)后良好的患者

2、與臨床治療反應(yīng)不相符,出現(xiàn)治療效果差,難緩解,緩解后易復(fù)發(fā)等情況。提示除已有的細(xì)胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)檢測(cè)指標(biāo)及可能的檢測(cè)誤差等因素外,尚有許多更復(fù)雜的白血病預(yù)后因素尚未闡明。因此需要探索更全面、更準(zhǔn)確的反映白血病患者預(yù)后的檢測(cè)指標(biāo)及方法。
　　蛋白芯片(proteinmicroarray,或proteinchips)是高通量、高靈敏度、易于操作、實(shí)用性高的蛋白質(zhì)研究工具。我們本課題選用RayBiotech可一次性檢測(cè)507種人類蛋

3、白表達(dá)水平的生物素標(biāo)記抗體芯片,檢測(cè)目標(biāo)蛋白包括血管生成因子、炎癥因子、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、細(xì)胞粘附分子、可溶性受體、趨化因子和其他蛋白等。該芯片在鑒定關(guān)鍵發(fā)病因素、篩選生物標(biāo)志物和藥物靶標(biāo)等方面已顯示了較為廣泛的應(yīng)用價(jià)值。故我們應(yīng)用該芯片對(duì)具有不同細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)標(biāo)志的AML患者血清標(biāo)本進(jìn)行了檢測(cè),期望篩選出臨床判斷AML預(yù)后價(jià)值的分子標(biāo)志物,為后續(xù)制備用于臨床預(yù)測(cè)AML患者預(yù)后和指導(dǎo)個(gè)體化治療的蛋白芯片奠定基礎(chǔ)。
　　方

4、法：
　　1、收集從2011年08月至2013年01月在我科就診的AML初診患者(非APL)113例,根據(jù)細(xì)胞遺傳學(xué)標(biāo)志、基因檢測(cè)和臨床治療效果進(jìn)行分析,將其分為預(yù)后良好、預(yù)后中等和預(yù)后不良組。
　　2、蛋白芯片篩選AML血清標(biāo)志物:應(yīng)用可一次性檢測(cè)507種人類蛋白表達(dá)水平的生物素標(biāo)記抗體芯片,對(duì)11例初診AML和5例健康對(duì)照組的血清標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。
　　3、檢測(cè)AML血清中OPN的含量:應(yīng)用ELISA法對(duì)18例AML(

5、9例預(yù)后良好組,9例預(yù)后不良組)和9例健康對(duì)照組的血清進(jìn)行檢測(cè)。
　　4、采用AAH-BLM-1的數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)分析,數(shù)據(jù)以x±S表示,并進(jìn)行t檢驗(yàn)。
　　結(jié)果：
　　1、根據(jù)初診AML患者的年齡、初診時(shí)白細(xì)胞總數(shù)(WBC)、細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)標(biāo)志以及臨床治療反應(yīng)將接受了治療的71例患者進(jìn)行分組,預(yù)后良好組10例,預(yù)后中等組27例,預(yù)后不良組34例。從預(yù)后良好組和預(yù)后不良組中篩選出11例AML患者

6、為后續(xù)試驗(yàn)做準(zhǔn)備。
　　2、11例AML與5例正常對(duì)照組比較,22個(gè)標(biāo)志因子在AML中高表達(dá)(P<0.05)。包括生長(zhǎng)因子:MFG-E8、Osteoactivin、Hepassocin、M-CSF、M-CSFR、InsulinR;白介素家族:IL-20、IL-3、IL-1F8/FIL1eta、IL-2Ralpha、IL-2Rbeta/CD122、IL-1R6/IL-1Rrp2;凋亡因子:Fas/CD95;粘附分子:ICAM-3/C

7、D50;趨化因子:6Ckine/CCL21;脂質(zhì)運(yùn)載蛋白:Lipocalin-1;新型跨膜蛋白:TMEFF1/Tomoregulin-1;基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員:MMP-3;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族成員:GFRalpha-4;腫瘤壞死因子受體超家族:TNF-alpha、GITR/TNFRF18、DR6/TNFRSF21。
　　3、6例預(yù)后不良組和5例預(yù)后良好組AML比較,11個(gè)標(biāo)志因子在預(yù)后不良組中高表達(dá)(P<0.05)。包括生長(zhǎng)因子:

8、VEGF-D、IGFBP1;基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑:TIMP-2;內(nèi)源性血管生成抑制劑:ES;蛋白水解酶:UPA;趨化因子:MIP-2、FGF-19;結(jié)合蛋白:LBP;黏附分子:L-selectin/CD62L;載脂蛋白:SAA;白介素17受體:IL-17RD。
　　4、ELISA法檢測(cè)AML和健康對(duì)照組血清標(biāo)本,結(jié)果顯示AML預(yù)后不良組(FLT3/ITD陽(yáng)性)血清OPN含量明顯高于預(yù)后良好組(AML1/ETO、NPM1陽(yáng)性)和健康

9、對(duì)照組(P<0.05)。AML預(yù)后良好組(AML1/ETO、NPM1陽(yáng)性)血清OPN含量明顯高于健康對(duì)照組(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、AML的預(yù)后和危險(xiǎn)度分層與患者發(fā)病年齡、初診時(shí)WBC、細(xì)胞類型、細(xì)胞遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)標(biāo)志以及臨床治療效果等均密切相關(guān)。
　　2、蛋白芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在AML細(xì)胞中有22個(gè)標(biāo)志因子高表達(dá),對(duì)AML細(xì)胞凋亡、增殖、分化及浸潤(rùn)起到了重要作用,并與AML的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。
　

10、　3、與預(yù)后良好組比較,11個(gè)標(biāo)志因子在AML預(yù)后不良組中高表達(dá),其參與了AML的髓外浸潤(rùn)、凝血和纖溶系統(tǒng)的調(diào)節(jié)、造血干細(xì)胞移植后的造血重建等過(guò)程。可作為構(gòu)建AML預(yù)后判斷的新指標(biāo)體系的依據(jù),為預(yù)測(cè)AML預(yù)后、指導(dǎo)臨床個(gè)體化治療提供新的手段和方法。
　　4、伴有FLT3/ITD陽(yáng)性的預(yù)后不良AML患者OPN表達(dá)明顯高于預(yù)后良好組,證實(shí)OPN在AML中是一個(gè)預(yù)后不良因素。也進(jìn)一步驗(yàn)證了AML血清標(biāo)本的穩(wěn)定性和所做蛋白芯片檢測(cè)的可靠性