飽餐與饑餓對小鼠動脈粥樣硬化形成及心肌能量代謝的影響及機制研究.pdf

1、本文分為三個部分進行探討：
　?、?血清可溶性TRAIL含量在高脂血癥人群中升高
　　目的：
　　對352例納入者體內(nèi)生化參數(shù)及sTRAIL水平的測量及分析，觀察我國漢族人群中血清sTRAIL濃度與總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇等血脂水平之間的相關(guān)性，并將相關(guān)血脂參數(shù)的高低進行分區(qū)，觀察各區(qū)域之間是否存在差異性，以便進一步了解高脂血癥人群中sTRAIL的水平。
　　方法：
　　1.病例選擇

2、
　　本臨床研究病例均來自醫(yī)院健康體檢中心。納入者在健康體檢中心在完成常規(guī)的個人注冊并剔除特定的疾病的檢查。排除了糖尿病、自身免疫性疾病、炎癥性疾病、冠心病以及年齡和性別等其他條件的限制。
　　2.血清樣本生化測量和數(shù)據(jù)收集
　　血生化樣本的測量主要為總膽固醇、甘油三酯、LDL-C和HDL-C。其他生理學數(shù)據(jù)主要來自健康體檢納入者本人的健康體檢報告。
　　3.sTRAIL水平的測定
　　使用靜脈采血針抽取健

3、康體檢納入者隔夜空腹靜脈血0.5ml。室溫離心后取上層血清。血清樣本存于-80℃冰箱以備使用。sTRAIL血清濃度測量主要采用了不同供應商供應的ELISA試劑盒。嚴格按照試劑盒的相關(guān)說明書進行sTRAIL濃度的檢測。
　　結(jié)果：
　　1.健康體檢納入者的基本情況
　　392例健康體檢者符合納入標準，最終入選352例健康體檢者的基本情況。納入者年齡范圍在30-68之間。大約有15％的參與者血壓超過正常血壓值。大約一半的納

4、入者，其血液中總膽固醇水平要高于正常值(總膽固醇正常值為≤5.2mmol/L)。大于45％的為超重的人群（身高體重指數(shù)BMI＞24）或者是肥胖的人群。
　　2.不同的ELISA試劑盒影響了檢測結(jié)果的多樣性
　　首先測試不同的ELISA試劑盒是否會影響結(jié)果的多樣性。我們隨機選取了16個人的血清樣品為一個實驗組，用三種不同的商業(yè)試劑盒來測量其sTRAIL的含量。其中有兩個試劑盒所測得的結(jié)果具有大致上的可比性的數(shù)據(jù)，而另外一個試劑

5、盒則測出來的數(shù)據(jù)結(jié)果差別比較大。故而在接下來的所有實驗中，我們均選用R&D Systems的試劑盒來測量sTRAIL的濃度，并且這一試劑盒在現(xiàn)階段的研究中，使用的頻率對比其他廠家的產(chǎn)品而言較高。從我們的實驗中可以看出，不論采用何種ELISA試劑盒，各個試劑盒之間總會存在或多或少的誤差。
　　3.在以性別，BMI，年齡為分界值分組的情況下，TC升高者中的sTRAIL水平顯著升高
　　以5.2mmol/L的TC水平為分界值，分析

6、后發(fā)現(xiàn)sTRAIL的水平在血清TC水平升高組(TC-high group)中是顯著升高的，且P＜0.001。以TC水平在5.7 mmol/L為一個分界值，分析了sTRAIL水平的差異性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清TC水平升高組(TC-high group)的sTRAIL濃度為126.8±6.7pg/ml，依然要高于血清TC水平正常組(TC-Norm group)的113.6±4.1 pg/ml(P＜0.005)。男性體內(nèi)血清TC水平升高組(TC-h

7、igh group)的sTRAIL的平均水平要顯著高于血清TC水平正常組(TC-Norm group)。而女性體內(nèi)sTRAIL的平均水平與男性相差無幾。我們將納入者根據(jù)其身高體重指數(shù)分為BMI＜24的正常體重組(normal bodyweight)和BMI≥24的超重或者肥胖組(overweight/obese)。在這兩個子組中，血清TC水平正常組(TC-Norm group)和血清TC水平升高組(TC-high group)中sTRA

8、IL水平也具有顯著地差異性。此外，在不同的年齡段中，血清TC水平升高組(TC-highgroup)中sTRAIL水平也顯著升高。
　　結(jié)論：
　　1.在性別，BMI，年齡不同的情況下，血清總膽固醇水平與sTRAIL濃度之間具有顯著的正相關(guān)關(guān)系
　　2.在較高的LDL-C水平為分界值的情況下，LDL-C水平與sTRAIL濃度之間具有顯著地正相關(guān)關(guān)系
　?、?Death Receptor5在飽餐導致的動脈粥樣硬化形成

9、中的作用
　　目的：
　　1.觀察長期飽食高熱量飲食條件下，雙敲小鼠體重，附睪、腸系膜和腎周圍脂肪墊的重量及體內(nèi)血清膽固醇、血糖、高低密度膽固醇和甘油三酯等生化參數(shù)的改變。
　　2.觀察長期飽食高熱量飲食條件下，DR5敲除后，雙敲小鼠血管動脈粥樣硬化斑塊面積的改變。
　　方法：
　　1.實驗動物來源:
　　8周齡雄性apoE-/-小鼠和C57BL/6為背景的野生型小鼠購自北京維通利華公司，8周齡雄性L

10、DLR-/-小鼠購自南京大學模式動物研究所，DR5-/-小鼠購自美國Mutant Mouse Regional Resource Centers(MMRRC)。所有動物實驗均符合山東大學齊魯醫(yī)院倫理委員會對動物實驗的要求和規(guī)定。
　　2.雙敲小鼠模型構(gòu)建:
　　將8周齡的apoE-/-小鼠和LDLR-/-小鼠分別與DR5-/-小鼠按照一雄兩雌進行交配繁殖，雜一代基因型均為DR5+/-apoE+/-和LDLR+/-apoE+/

11、-小鼠。雜一代在8周齡時繼續(xù)進行模型構(gòu)建，后代經(jīng)鼠尾組織DNA提取后分析后分出DR5-/-apoE-/-和DR5+/+apoE-/-小鼠及DR5-/-LDLR-/-和DR5+/+ LDLR-/-小鼠四個基因型。
　　3.實驗分組:
　　將上述四個基因型小鼠進行分組，每個基因型分為正常飲食組和高熱量飲食組，喂養(yǎng)16周。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建雙敲基因型小鼠
　　本實驗以C57BL/6背景的apoE-/-

12、和DR5-/-小鼠及LDLR-/-與DR5-/-小鼠為基礎(chǔ)，構(gòu)建雙敲小鼠模型。經(jīng)過一年半的時間對雙敲小鼠進行基因篩選，從12547只雜合子小鼠中經(jīng)過基因鑒定確定四種基因型的純合子，分別為DR5-/-apoE-/-和DR5+/+ apoE-/-小鼠及DR5-/-LDLR-/-和DR5+/+ LDLR-/-小鼠四個基因型。
　　2.各基因型小鼠體重結(jié)果
　　經(jīng)過16周相應飲食的喂養(yǎng)，其體重較最初入組時明顯增加。其中各個基因型以高

13、熱量飲食喂養(yǎng)的小鼠體重增加相對值要遠遠高于正常飲食喂養(yǎng)的小鼠。其中DR5-/-apoE-/-高熱量飲食組小鼠體重增加比例最高，DR5+/+apoE-/-高熱量飲食組小鼠體重增加比例最低，但遠遠高于正常飲食組小鼠，并且其增加的比例與小鼠基因型無關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1.雙敲小鼠高熱量飲食后，體重，附睪周圍脂肪墊、腸系膜周圍脂肪墊及腎周脂肪墊、部分血清生化參數(shù)水平等顯著高于正常飲食組。
　　2.高熱量飲食條件下，雙敲小鼠體

14、內(nèi)DR5敲除后主動脈弓血管斑塊面積顯著減小。且斑塊面積的減少與體重，附睪周圍脂肪墊、腸系膜周圍脂肪墊及腎周脂肪墊、血清生化參數(shù)水平等的改變沒有相關(guān)性。且DR5敲除后能夠減小長期飽食膏脂之品誘導的動脈粥樣硬化斑塊面積，對動脈粥樣硬化斑塊的形成起到抑制作用。
　　Ⅲ 饑餓對心肌糖脂代謝及心功能的影響
　　目的：
　　1.熱量限制飲食對心肌糖脂代謝的影響
　　2.熱量限制飲食對心功能的影響
　　方法：
　　

15、1.實驗對象及分組
　　C57BL/6小鼠20只，雄性，8周齡，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。將其隨機分為2組:正常飲食組(CF)和熱量限制飲食組(CR)，每組10只，相應飲食16周。正常飲食(20.11％蛋白質(zhì)，4.84％脂質(zhì)，7.34％粗纖維，總能量為17.3282MJ/kg)，熱量限制飲食為正常飲食的30％。
　　2.超聲心動圖檢測
　　在相應飲食后16周進行心臟超聲心動圖檢測。選取頻率為35MHz的超聲

16、探頭進行心臟大小和功能參數(shù)的采集，采用高分辨率超聲Vevo770系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)分析。左室長軸和短軸切面記錄超聲圖像。M型超聲檢測左室舒張末內(nèi)徑、左室收縮末內(nèi)徑、舒張末室間隔厚度、舒張末左室后壁厚度。左室短軸縮短率、射血分數(shù)和校正的左室質(zhì)量由超聲系統(tǒng)自動計算。
　　結(jié)果：
　　1.熱量限制飲食通過PI3K/AKT通路提高了心肌Sirt1的蛋白表達水平
　　給予小鼠16周相關(guān)飲食后，安樂死取材。我們對部分心臟組織進行蛋白提取

17、。用western blot的方法檢測發(fā)現(xiàn)，Sirt1在熱量限制飲食條件下，蛋白表達水平顯著升高。檢測了其上游蛋白PI3K/AKT的相關(guān)蛋白水平發(fā)現(xiàn)，在熱量限制飲食條件下PI3K蛋白水平升高，且與Sirt1升高具有相關(guān)性。PI3K蛋白的下游靶點蛋白AKT的水平較正常飲食也是顯著升高的。
　　2.熱量限制飲食情況下，心肌糖脂代謝相關(guān)基因表達升高
　　利用RT-PCR的方法對心肌糖脂代謝相關(guān)基因進行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，糖代謝相關(guān)基因