飽餐與饑餓對(duì)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化形成及心肌能量代謝的影響及機(jī)制研究.pdf

1、本文分為三個(gè)部分進(jìn)行探討：
　?、?血清可溶性TRAIL含量在高脂血癥人群中升高
　　目的：
　　對(duì)352例納入者體內(nèi)生化參數(shù)及sTRAIL水平的測(cè)量及分析，觀察我國(guó)漢族人群中血清sTRAIL濃度與總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇等血脂水平之間的相關(guān)性，并將相關(guān)血脂參數(shù)的高低進(jìn)行分區(qū)，觀察各區(qū)域之間是否存在差異性，以便進(jìn)一步了解高脂血癥人群中sTRAIL的水平。
　　方法：
　　1.病例選擇

2、
　　本臨床研究病例均來(lái)自醫(yī)院健康體檢中心。納入者在健康體檢中心在完成常規(guī)的個(gè)人注冊(cè)并剔除特定的疾病的檢查。排除了糖尿病、自身免疫性疾病、炎癥性疾病、冠心病以及年齡和性別等其他條件的限制。
　　2.血清樣本生化測(cè)量和數(shù)據(jù)收集
　　血生化樣本的測(cè)量主要為總膽固醇、甘油三酯、LDL-C和HDL-C。其他生理學(xué)數(shù)據(jù)主要來(lái)自健康體檢納入者本人的健康體檢報(bào)告。
　　3.sTRAIL水平的測(cè)定
　　使用靜脈采血針抽取健

3、康體檢納入者隔夜空腹靜脈血0.5ml。室溫離心后取上層血清。血清樣本存于-80℃冰箱以備使用。sTRAIL血清濃度測(cè)量主要采用了不同供應(yīng)商供應(yīng)的ELISA試劑盒。嚴(yán)格按照試劑盒的相關(guān)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行sTRAIL濃度的檢測(cè)。
　　結(jié)果：
　　1.健康體檢納入者的基本情況
　　392例健康體檢者符合納入標(biāo)準(zhǔn)，最終入選352例健康體檢者的基本情況。納入者年齡范圍在30-68之間。大約有15％的參與者血壓超過(guò)正常血壓值。大約一半的納

4、入者，其血液中總膽固醇水平要高于正常值(總膽固醇正常值為≤5.2mmol/L)。大于45％的為超重的人群（身高體重指數(shù)BMI＞24）或者是肥胖的人群。
　　2.不同的ELISA試劑盒影響了檢測(cè)結(jié)果的多樣性
　　首先測(cè)試不同的ELISA試劑盒是否會(huì)影響結(jié)果的多樣性。我們隨機(jī)選取了16個(gè)人的血清樣品為一個(gè)實(shí)驗(yàn)組，用三種不同的商業(yè)試劑盒來(lái)測(cè)量其sTRAIL的含量。其中有兩個(gè)試劑盒所測(cè)得的結(jié)果具有大致上的可比性的數(shù)據(jù)，而另外一個(gè)試劑

5、盒則測(cè)出來(lái)的數(shù)據(jù)結(jié)果差別比較大。故而在接下來(lái)的所有實(shí)驗(yàn)中，我們均選用R&D Systems的試劑盒來(lái)測(cè)量sTRAIL的濃度，并且這一試劑盒在現(xiàn)階段的研究中，使用的頻率對(duì)比其他廠家的產(chǎn)品而言較高。從我們的實(shí)驗(yàn)中可以看出，不論采用何種ELISA試劑盒，各個(gè)試劑盒之間總會(huì)存在或多或少的誤差。
　　3.在以性別，BMI，年齡為分界值分組的情況下，TC升高者中的sTRAIL水平顯著升高
　　以5.2mmol/L的TC水平為分界值，分析

6、后發(fā)現(xiàn)sTRAIL的水平在血清TC水平升高組(TC-high group)中是顯著升高的，且P＜0.001。以TC水平在5.7 mmol/L為一個(gè)分界值，分析了sTRAIL水平的差異性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清TC水平升高組(TC-high group)的sTRAIL濃度為126.8±6.7pg/ml，依然要高于血清TC水平正常組(TC-Norm group)的113.6±4.1 pg/ml(P＜0.005)。男性體內(nèi)血清TC水平升高組(TC-h

7、igh group)的sTRAIL的平均水平要顯著高于血清TC水平正常組(TC-Norm group)。而女性體內(nèi)sTRAIL的平均水平與男性相差無(wú)幾。我們將納入者根據(jù)其身高體重指數(shù)分為BMI＜24的正常體重組(normal bodyweight)和BMI≥24的超重或者肥胖組(overweight/obese)。在這兩個(gè)子組中，血清TC水平正常組(TC-Norm group)和血清TC水平升高組(TC-high group)中sTRA

8、IL水平也具有顯著地差異性。此外，在不同的年齡段中，血清TC水平升高組(TC-highgroup)中sTRAIL水平也顯著升高。
　　結(jié)論：
　　1.在性別，BMI，年齡不同的情況下，血清總膽固醇水平與sTRAIL濃度之間具有顯著的正相關(guān)關(guān)系
　　2.在較高的LDL-C水平為分界值的情況下，LDL-C水平與sTRAIL濃度之間具有顯著地正相關(guān)關(guān)系
　　Ⅱ Death Receptor5在飽餐導(dǎo)致的動(dòng)脈粥樣硬化形成

9、中的作用
　　目的：
　　1.觀察長(zhǎng)期飽食高熱量飲食條件下，雙敲小鼠體重，附睪、腸系膜和腎周圍脂肪墊的重量及體內(nèi)血清膽固醇、血糖、高低密度膽固醇和甘油三酯等生化參數(shù)的改變。
　　2.觀察長(zhǎng)期飽食高熱量飲食條件下，DR5敲除后，雙敲小鼠血管動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積的改變。
　　方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)源:
　　8周齡雄性apoE-/-小鼠和C57BL/6為背景的野生型小鼠購(gòu)自北京維通利華公司，8周齡雄性L

10、DLR-/-小鼠購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，DR5-/-小鼠購(gòu)自美國(guó)Mutant Mouse Regional Resource Centers(MMRRC)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合山東大學(xué)齊魯醫(yī)院倫理委員會(huì)對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的要求和規(guī)定。
　　2.雙敲小鼠模型構(gòu)建:
　　將8周齡的apoE-/-小鼠和LDLR-/-小鼠分別與DR5-/-小鼠按照一雄兩雌進(jìn)行交配繁殖，雜一代基因型均為DR5+/-apoE+/-和LDLR+/-apoE+/

11、-小鼠。雜一代在8周齡時(shí)繼續(xù)進(jìn)行模型構(gòu)建，后代經(jīng)鼠尾組織DNA提取后分析后分出DR5-/-apoE-/-和DR5+/+apoE-/-小鼠及DR5-/-LDLR-/-和DR5+/+ LDLR-/-小鼠四個(gè)基因型。
　　3.實(shí)驗(yàn)分組:
　　將上述四個(gè)基因型小鼠進(jìn)行分組，每個(gè)基因型分為正常飲食組和高熱量飲食組，喂養(yǎng)16周。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建雙敲基因型小鼠
　　本實(shí)驗(yàn)以C57BL/6背景的apoE-/-

12、和DR5-/-小鼠及LDLR-/-與DR5-/-小鼠為基礎(chǔ)，構(gòu)建雙敲小鼠模型。經(jīng)過(guò)一年半的時(shí)間對(duì)雙敲小鼠進(jìn)行基因篩選，從12547只雜合子小鼠中經(jīng)過(guò)基因鑒定確定四種基因型的純合子，分別為DR5-/-apoE-/-和DR5+/+ apoE-/-小鼠及DR5-/-LDLR-/-和DR5+/+ LDLR-/-小鼠四個(gè)基因型。
　　2.各基因型小鼠體重結(jié)果
　　經(jīng)過(guò)16周相應(yīng)飲食的喂養(yǎng)，其體重較最初入組時(shí)明顯增加。其中各個(gè)基因型以高

13、熱量飲食喂養(yǎng)的小鼠體重增加相對(duì)值要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常飲食喂養(yǎng)的小鼠。其中DR5-/-apoE-/-高熱量飲食組小鼠體重增加比例最高，DR5+/+apoE-/-高熱量飲食組小鼠體重增加比例最低，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常飲食組小鼠，并且其增加的比例與小鼠基因型無(wú)關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1.雙敲小鼠高熱量飲食后，體重，附睪周圍脂肪墊、腸系膜周圍脂肪墊及腎周脂肪墊、部分血清生化參數(shù)水平等顯著高于正常飲食組。
　　2.高熱量飲食條件下，雙敲小鼠體

14、內(nèi)DR5敲除后主動(dòng)脈弓血管斑塊面積顯著減小。且斑塊面積的減少與體重，附睪周圍脂肪墊、腸系膜周圍脂肪墊及腎周脂肪墊、血清生化參數(shù)水平等的改變沒(méi)有相關(guān)性。且DR5敲除后能夠減小長(zhǎng)期飽食膏脂之品誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成起到抑制作用。
　?、?饑餓對(duì)心肌糖脂代謝及心功能的影響
　　目的：
　　1.熱量限制飲食對(duì)心肌糖脂代謝的影響
　　2.熱量限制飲食對(duì)心功能的影響
　　方法：
　　

15、1.實(shí)驗(yàn)對(duì)象及分組
　　C57BL/6小鼠20只，雄性，8周齡，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。將其隨機(jī)分為2組:正常飲食組(CF)和熱量限制飲食組(CR)，每組10只，相應(yīng)飲食16周。正常飲食(20.11％蛋白質(zhì)，4.84％脂質(zhì)，7.34％粗纖維，總能量為17.3282MJ/kg)，熱量限制飲食為正常飲食的30％。
　　2.超聲心動(dòng)圖檢測(cè)
　　在相應(yīng)飲食后16周進(jìn)行心臟超聲心動(dòng)圖檢測(cè)。選取頻率為35MHz的超聲

16、探頭進(jìn)行心臟大小和功能參數(shù)的采集，采用高分辨率超聲Vevo770系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。左室長(zhǎng)軸和短軸切面記錄超聲圖像。M型超聲檢測(cè)左室舒張末內(nèi)徑、左室收縮末內(nèi)徑、舒張末室間隔厚度、舒張末左室后壁厚度。左室短軸縮短率、射血分?jǐn)?shù)和校正的左室質(zhì)量由超聲系統(tǒng)自動(dòng)計(jì)算。
　　結(jié)果：
　　1.熱量限制飲食通過(guò)PI3K/AKT通路提高了心肌Sirt1的蛋白表達(dá)水平
　　給予小鼠16周相關(guān)飲食后，安樂(lè)死取材。我們對(duì)部分心臟組織進(jìn)行蛋白提取

17、。用western blot的方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Sirt1在熱量限制飲食條件下，蛋白表達(dá)水平顯著升高。檢測(cè)了其上游蛋白PI3K/AKT的相關(guān)蛋白水平發(fā)現(xiàn)，在熱量限制飲食條件下PI3K蛋白水平升高，且與Sirt1升高具有相關(guān)性。PI3K蛋白的下游靶點(diǎn)蛋白AKT的水平較正常飲食也是顯著升高的。
　　2.熱量限制飲食情況下，心肌糖脂代謝相關(guān)基因表達(dá)升高
　　利用RT-PCR的方法對(duì)心肌糖脂代謝相關(guān)基因進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，糖代謝相關(guān)基因