MMP--2酶刺激響應性納米給藥系統的構建及其體內外評價.pdf

1、目的:設計一種腫瘤微環(huán)境酶刺激響應性的納米給藥系統以便提高阿霉素(Doxorubicin，DOX)在腫瘤組織的滲透能力、提高DOX的療效，并減少DOX對正常組織器官的毒副作用。
　　方法:1.建立了阿霉素的體外分析方法學;2.將樹枝狀大分子聚酰胺-胺（Polyamidoamine，PAMAM）與多糖透明質酸(Haluronic acid，HA)通過基質金屬蛋白酶2（Matrix metalloproteinase-2，MMP-2）

2、的底物多肽(Gly-PLGLAG-Cys)相連接，得到具有MMP-2刺激響應性的納米載體HA-pep-PAMAM。同時制備不含MMP-2底物多肽的HA-PAMAM。通過NMR分析PAMAM表面HA的接枝率，篩選優(yōu)化處方，并對其進行理化性質表征，主要包括表面形態(tài)、粒徑、表面電位、載藥量、釋藥行為和載體的酶響應性;3.利用CCK-8法考察納米制劑對MMP-2高表達腫瘤細胞A549和MMP-2低表達腫瘤細胞MCF7增殖的影響;4.利用流式細胞

3、術考察不同處理條件下細胞對藥物制劑攝取能力的影響;5.建立3D腫瘤球模型并采用激光共聚焦顯微鏡考察納米制劑對3D腫瘤球的滲透能力，同時考察納米制劑對腫瘤球生長的抑制效果;6.建立荷A549腫瘤動物模型，考察納米制劑的體內靶向效果和抗腫瘤效果，并對其進行安全性評價。
　　結果:1.采用紫外分光光度計建立了DOX測定方法，結果表明該方法簡單、準確，符合實驗要求;2.以MMP-2底物多肽(Gly-PLGLAG-Cys)為linker將包

4、載模型藥物DOX的樹枝狀大分子PAMAM與親水性多糖HA相連，制備了具有腫瘤微環(huán)境酶刺激響應性的納米載體。同時采用胺化還原反應將HA和PAMAM直接相連，得到MMP-2非敏感的HA-PAMAM載體。所制備的兩種納米載體形態(tài)均為類球形，粒徑大小接近，分布均勻;具有相同的載藥量及藥物釋放行為。通過CTAB（Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide，十六烷基三甲基溴化銨）濁度法和TEM證明HA-pep-PAMA

5、M能夠在MMP-2的作用下，斷裂載體上的底物多肽，進而切除載體表面的HA、釋放出小粒徑的PAMAM;3.對于MMP-2高表達的A549細胞，HA-pep-PAMAM/DOX納米制劑在有無MMP-2預處理的情況下，對細胞增殖并無顯著性差異，對于MMP-2低表達的MCF7細胞，MMP-2處理后的HA-pep-PAMAM/DOX納米制劑的細胞毒性明顯高于未經酶處理的制劑;4.流式細胞術結果表明，A549和MCF7兩種細胞對經酶預處理的HA-p

6、ep-PAMAM/DOX的攝取量均有顯著性提高，表明HA-pep-PAMAM/DOX具有酶刺激響應性;5.腫瘤球實驗結果顯示，納米制劑與腫瘤球共孵育4h和24h后，經MMP-2酶預處理后的HA-pep-PAMAM/DOX更多地滲透到腫瘤球內部;腫瘤球生長抑制實驗結果表明，HA-pep-PAMAM/DOX使得腫瘤球結構疏松，邊緣細胞凋亡并脫落，表現出一定的抑制作用;6.體內分布實驗結果表明，與游離吲哚菁綠(Indocyanine Gree

7、n，ICG)和PAMAM包載的ICG相比，進行了HA修飾的HA-PAMAM/ICG、HA-pep-PAMAM/ICG具有更好的腫瘤靶向性，在腫瘤部位的蓄積也顯著增高;體內抗腫瘤效果顯示，與PBS組和空白制劑組相比，DOX溶液組和HA-pep-PAMAM/DOX組均有效地抑制了體內腫瘤的生長。而且與DOX溶液相比，HA-pep-PAMAM/DOX的抑瘤效果更加顯著，同時減少了游離DOX導致的動物體重減少及心臟、肝臟毒性等副作用。