環(huán)境響應(yīng)型肝靶向納米凝膠給藥系統(tǒng)研究.pdf

1、本課題首先合成了環(huán)境響應(yīng)型殼聚糖聚合物,并首次將此聚合物與乳糖酸縮合制備具有肝細(xì)胞靶向作用的半乳糖化殼聚糖材料。以冬凌草甲素(Oridonin,ORI)為模型藥物,采用自組裝法制備半乳糖化及未半乳糖化的冬凌草甲素納米凝膠制劑,并對上述兩種納米制劑的體內(nèi)外抗腫瘤活性進(jìn)行考察,為肝癌靶向制劑的開發(fā)提供理論和實驗依據(jù)。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　 1.殼聚糖-g-聚(N-異丙基丙烯酰胺)納米凝膠作為藥物載體的研究
　　 以殼

2、聚糖和N-異丙基丙烯酰胺為原料,采用自由基聚合法制備具有環(huán)境pH響應(yīng)特性的殼聚糖-g-聚(N-異丙基丙烯酰胺)(CS-g-PNIPAm),并采用FTIR、1H-NMR和XRD等方法對該聚合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行確證。以O(shè)RI為模型藥物,采用自組裝法制備載藥納米凝膠(ORI-CS-NG),并考察各種制備條件對納米凝膠中藥物包封率的影響;結(jié)果表明,ORI-CS-NG中藥物包封率受到載體材料用量和載體聚合物制備條件的影響。透射電鏡和激光光散射分析顯示OR

3、I-CS-NG為類球形、表面光滑圓整、粒徑分布窄、平均粒徑在100nm左右。ORI-CS-NG的XRD分析結(jié)果表明ORI在納米凝膠中以分子、微晶或無定形狀態(tài)存在。以透析法考察ORI-CS-NG中ORI的體外釋放行為,結(jié)果表明制劑中藥物的釋放具有明顯的pH敏感特性:在pH7.4的釋放介質(zhì)中,12h的藥物累積釋放量低于50％;而在弱酸性的釋放介質(zhì)中(pH6.5、6.0和5.0),12h時藥物累積釋放量超過80％。采用MTT比色法考察空白納米

4、凝膠(CS-NG)及ORI-CS-NG對人肝癌HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。結(jié)果表明CS-NG無明顯的細(xì)胞毒性,而ORI-CS-NG對HepG2細(xì)胞的抗腫瘤活性隨藥物濃度的增加和作用時間的延長而增強(qiáng);ORI和ORI-CS-NG對HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒作用均具有pH敏感特性,在弱酸性條件下這兩種制劑的抗腫瘤活性增強(qiáng);且ORI-CS-NG的抗肝癌活性明顯高于ORI。ORI-CS-NG在pH7.4和6.5時對HepG2細(xì)胞的IC50值分別為13

5、.18和8.86μg/mL,而ORI在pH7.4和6.5時的IC50值分別為16.94和12.00μg/mL。對HepG2細(xì)胞形態(tài)考察結(jié)果表明CS-NG無明顯的細(xì)胞毒性,而ORI-CS-NG可顯著提高ORI體外對HepG2的抗腫瘤活性。
　　 2.半乳糖化殼聚糖-g-聚(N-異丙基丙烯酰胺)納米凝膠作為藥物載體的研究利用殼聚糖結(jié)構(gòu)中的氨基和乳糖酸結(jié)構(gòu)中的羧基在EDC作用下進(jìn)行縮合,制備半乳糖化殼聚糖-g-聚(N-異丙基丙烯酰胺)

6、(Gal-CS-g-PNIPAm)聚合物,采用FTIR、1H-NMR和XRD等方法對該產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。Gal-CS-g-PNIPAm中半乳糖的取代度采用1H-NMR進(jìn)行測定,結(jié)果表明隨著反應(yīng)體系中乳糖酸用量的增加,Gal-CS-g-PNIPAm中半乳糖的取代度先增加后降低。選擇取代度分別為7.26％,11.95％和14.06％的Gal-CS-g-PNIPAm作為載體進(jìn)行實驗,采用自組裝法制備冬凌草甲素Gal-CS-g-PNIPAm納

7、米凝膠(ORI-GC-NG),三種載藥納米凝膠均為類球形,表面光滑,粒徑分布均勻,平均粒徑在200nm左右。隨著聚合物中半乳糖取代度的增加,ORI-GC-NG中藥物包封率與Z-電位均逐漸降低。對ORI-GC-NG的XRD分析結(jié)果說明ORI在此三種納米凝膠制劑中均以分子、微晶或無定形狀態(tài)存在。以透析法測定上述三種ORI-GC-NG中ORI的體外釋放行為,結(jié)果表明ORI-GC-NG中藥物的釋放均具有pH敏感的特性,隨著釋放介質(zhì)pH的降低,釋

8、藥速率增加。采用MTT法分別考察空白GaI-CS-g-PNIPAm納米凝膠(GC-NG)及三種ORI-GC-NG在不同pH條件下對HepG2和人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞毒作用,結(jié)果表明GC-NG對這兩種腫瘤細(xì)胞均無明顯的毒性;ORI-GC-NG中隨著藥物濃度的增加,兩種腫瘤細(xì)胞的存活率均降低;pH相同時ORI-GC-NG對HepG2和MCF-7細(xì)胞的抗腫瘤活性比ORI強(qiáng)。ORI-GC-NG的抗腫瘤活性具有明顯的pH敏感特性,對HepG

9、2的細(xì)胞毒作用隨著pH的增加而降低,而對MCF-7細(xì)胞體外生長的抑制作用隨著pH的增加而增加;pH7.4時,ORI-GC-NG對HepG2和MCF-7細(xì)胞的抗腫瘤作用均高于ORI-CS-NG;而在pH6.5時,ORI-GC-NG對HepG2的增殖抑制效果要顯著高于ORI-CS-NG,但對MCF-7細(xì)胞的抑制作用要明顯低于ORI-CS-NG。
　　 3.冬凌草甲素納米凝膠組織分布、藥動學(xué)及其體內(nèi)抗腫瘤作用研究
　　 以O(shè)R

10、I為對照,研究了半乳糖化及未半乳糖化的載藥納米凝膠制劑(ORI-GC-NG和ORI-CS-NG)尾靜脈注射后在正常及荷瘤小鼠體內(nèi)各主要組織、器官中的經(jīng)時變化規(guī)律和分布情況,及其對荷肝癌H22小鼠的抑瘤效果。結(jié)果表明,在正常小鼠體內(nèi),ORI-CS-NG的相對攝取率從高到低依次為肝3.260、血1.914、脾1.294、肺1.112、心0.879和腎0.489;GCN-3(半乳糖取代度為14.06％的ORI-GC-NG)的相對攝取率依次排列

11、為肝6.335、血3.639、脾1.083、心0.992、肺0.727和腎0.434。而在荷瘤小鼠體內(nèi),ORI-CS-NG的相對攝取率從高到低依次為肝2.538、腫瘤2.280、血2.106、脾1.271、肺1.212、腎0.706和心0.518;GCN-3的相對攝取率依次排列為腫瘤5.672、肝4.171、血2.966、脾1.038、腎0.790、肺0.779和心0.708。GCN-3和ORI-CS-NG均具有明顯的腫瘤靶向性,而GC

12、N-3腫瘤靶向效果更佳。荷瘤小鼠尾靜脈注射ORI、ORI-CS-NG和GCN-3后血藥濃度-時間曲線均符合二室模型。ORI的主要藥動學(xué)參數(shù)為:半衰期t1/2α=0.721h,t1/2β=6.806h,血藥濃度-時間曲線下面積AUC0～∞=18.112(h·μg/mL),清除率CLs=0.442(mg/kg/h/(μg/mL));ORI-CS-NG的主要藥動學(xué)參數(shù)為:半衰期t1/2α=3.273h,t1/2β=69.315h,血藥濃度-時

13、間曲線下面積AUC0～∞=21.721(h·μg/mL),清除率CLs=0.243(mg/kg/h(μg/mL));GCN-3的主要藥動學(xué)參數(shù)為:半衰期t1/2α=3.755h,t1/2β=69.315h,血藥濃度-時間曲線下面積AUC0～∞=46.373(h·μg/mL),清除率CLs=0.171(mg/kg/h/(μg/mL))。由結(jié)果可知,上述兩種載藥納米凝膠可以顯著延長藥物ORI在體內(nèi)的消除半衰期t1/2β,明顯增加AUC,降低

14、藥物體內(nèi)清除率。采用動物移植性腫瘤的實驗方法,將小鼠肝癌H22細(xì)胞接種于昆明種小鼠皮下,進(jìn)行體內(nèi)抑瘤實驗;結(jié)果表明,在相同藥物劑量時,ORI的抗腫瘤活性最差,ORI-CS-NG和GCN-3的抑瘤率均有所提高,且GCN-3的抑瘤效果更強(qiáng)。在給藥量為8mg/(kg·d)時,ORI、ORI-CS-NG和GCN-3的抑瘤率分別為32.16％、51.80和70.76％,且此三種制劑的體內(nèi)毒性均較小。
　　 本研究選用具有環(huán)境pH響應(yīng)型智能