阿霉酮B納米結(jié)晶釋藥系統(tǒng)的構(gòu)建及體內(nèi)外評價.pdf

1、殼囊孢菌素B(Cytosporone B，Csn-B)是從小穴殼菌屬(Dothiorella sp.)真菌HTF3中分離得到的一種天然產(chǎn)物，是天然的Nur77受體激動劑，有較好的抗真菌及抗腫瘤活性。阿霉酮B(AmoitoneB，AmB)作為Csn-B系列衍生物的一種，由廈門大學化學系合成，具有更強的Nur77結(jié)合及激活特性，能夠特異地結(jié)合到Nur77配體結(jié)合區(qū)域，激活其活性，介導Nur77抑制抗細胞凋亡蛋白BRE(Brain and r

2、eproductive organ-expressed protein)的轉(zhuǎn)錄活性，轉(zhuǎn)移Nur77到線粒體中引起細胞色素C的釋放來誘導細胞凋亡及抑制腫瘤生長，可作為一種有前途的藥物用于癌癥的治療。阿霉酮B主要用于胃癌、結(jié)腸癌的治療;對肺癌、肝癌的治療還在研究階段。然而，阿霉酮B極難溶于水的特性導致其口服生物利用度低;采用有機溶劑溶解制成注射劑，易導致全身過敏反應，治療指數(shù)低。臨床需要一種給藥次數(shù)少、生物利用度高、穩(wěn)定性好、制備簡單且利于

3、患者使用的制劑。
　　 本課題采用納米結(jié)晶技術(nanocrystal technology)，用高壓微射流均質(zhì)法(microfluidization method)將阿霉酮B制備成納米結(jié)晶混懸液(Amoitone B nanocrystal suspensions，AmB-NSP)。本文首先考察了微射流均質(zhì)過程中壓力及循環(huán)次數(shù)對阿霉酮B納米結(jié)晶的粒徑及多分散指數(shù)(polydispersity index，PI)的影響;同時以Z

4、eta電位為指標，采用正交實驗法對預選的穩(wěn)定劑Lecithin、PluronicF68、HPMC及PVPK30的組合及用量進行了篩選，得出AmB-NSP的最優(yōu)處方和工藝參數(shù)。然后將最優(yōu)工藝的AmB-NSP進行冷凍干燥，并對其凍干保護劑的種類、用量進行了篩選;測定了AmB-NSP凍干制劑的飽和溶解度及體外溶出度;采用DSC和XRD技術研究了AmB-NSP凍干制劑的晶型結(jié)構(gòu);同時對AmB-NSP凍干制劑在不同條件下的貯存穩(wěn)定性進行了研究。接

5、下來采用HPLC法對AmB-NSP靜脈注射后在家兔體內(nèi)的藥代動力學及小鼠體內(nèi)的組織分布特征進行了考察。本課題最后對AmB-NSP的體外抗腫瘤效果進行了系統(tǒng)考察，證實了AmB-NSP能顯著提高AmB對腫瘤細胞的殺傷作用。
　　 通過預實驗及正交實驗確定的AmB-NSP的最優(yōu)制備工藝如下:選擇Lecithin及PluronicF68作為聯(lián)合穩(wěn)定劑，原料藥AmB與Lecithin、F68的用量比為1∶1∶1。將AmB、F68、Leci

6、thin懸浮于50ml注射用水中，超聲處理15min后，高速剪切機20000rpm預分散10min。對所得的粗混懸液經(jīng)由微射流高壓均質(zhì)機于500bar、1000bar的壓力下分別均質(zhì)3次，再在1800bar下均質(zhì)15次，即得AmB-NSP。透射電鏡及激光衍射測定儀分析顯示，制得的AmB-NSP為類球形，表面光滑圓整，分布均勻，平均粒徑在256.3nm左右，多分散指數(shù)PI為0.206。AmB-NSP在4℃放置1個月，粒徑?jīng)]有較大改變，物理

7、穩(wěn)定性良好。
　　 本文選用5％(w/v)的甘露醇作為凍干保護劑，將優(yōu)化制得的AmB-NSP進行冷凍干燥，首先在-80℃的超低溫冰箱中預凍24h，然后在真空冷凍干燥機中(-50℃、15mTorr)凍干48h，即得AmB-NSP的凍干粉針。激光衍射測定儀分析顯示，AmB-NSP凍干粉針的平均粒徑為275.4±7.98nm，PI為0.220±0.013，Zeta電位為-24.05±0.59mV，與凍干前相比變化不大。DSC、XRD對

8、AmB-NSP的晶型分析結(jié)果表明，AmB在凍干品中仍以晶體形式存在，微射流及凍干過程未對其晶型結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。將AmB-NSP凍干粉于20～25℃、3～5℃條件下貯存三個月，仍為白色疏松的粉末，色澤均勻，再分散性良好，可長期貯存穩(wěn)定。
　　 本文采用恒溫磁力攪拌法對AmB-NSP凍干粉的飽和溶解度進行考察，結(jié)果顯示，納米結(jié)晶使AmB在0.1％SDS-水中的溶解度由26.94±0.58μg·ml-1提高到405.53±1.73μg·

9、ml-1;在0.05％Tween80-水中由72.11±1.23μg·ml-1提高到388.20±2.07μg·ml-1。采用小杯槳法對AmB-NSP凍干粉在0.05％Tween80-水中的體外溶出度進行考察，在5min時，AmB-NSP凍干粉中藥物的溶出度為53.33％，而原料藥僅為6.06％，提高了近9倍;120min時，AmB-NSP凍干粉中藥物溶出已達95.0％，而原料藥只溶出43.0％。可知AmB-NSP由于減小的粒徑及增大的

10、表面積導致AmB的溶解度及溶出速率大大提高。AmB-NSP的體外釋藥符合Biexponential方程:1-Q％=0.4845e-0.6036t+0.4483e-0.0324t,r=0.9991.
　　 以AmB-Sol為對照，系統(tǒng)研究了阿霉酮B納米結(jié)晶經(jīng)家兔耳緣靜脈注射后體內(nèi)的藥動學情況。AmB-Sol靜注后家兔體內(nèi)的藥動學方程為:C=4.422e-13.169t+1.416e-1.591t+0.453e-0.231t，Cma

11、x=3.262μg·ml-1，分布、消除半衰期及平均滯留時間MRT均很短，分別為t1/2β=0.436h，t1/2γ=2.999h，MRT=2.257h，清除率CL=2.327L·h-l·kg-1，AUC(0-∞)為3.439h·μg.ml-1，而靜脈注射AmB-NSP后，家兔體內(nèi)藥物動力學有明顯改變，其藥動學方程為:C=12.341e-14.699t+1.12e-1.035t+0.212e-0.082t，Cmax=5.202μg·ml

12、-1,t1/2β0.67h,t1/2γ=8.446h,MRT=3.703h,CL=1.632L·h-1·kg-1,可見消除半衰期及平均滯留時間MRT明顯延長，清除率降低。AUC(0-∞)則增大至4.902h·μg·ml-1。
　　 小鼠體內(nèi)組織分布試驗結(jié)果表明，AmB-Sol和AmB-NSP靜脈注射后藥物在各組織中的分布顯著不同。靜脈給予AmB-NSP后相對攝取率re從高到低依次為肝3.32、肺2.50、血2.07、脾1.42、

13、腎0.82、心0.77，顯示出明顯的肝、肺靶向性;同時，AmB-NSP相對于溶液劑在血漿及各組織的峰濃度比Ce為血1.78、心0.44、肝3.87、脾2.30、肺4.30、腎0.40，可見納米結(jié)晶使AmB在肝、肺及血漿中的分布大大提高，顯著降低了其在心、腎的分布，在一定程度上減少了心、腎毒性。
　　 本文采用MTT試驗、細胞熒光染色、流式周期及凋亡檢測試驗對AmB-NSP的體外抗腫瘤活性及凋亡機制進行了考察。MTT實驗顯示，Am

14、B-Sol培養(yǎng)BGC-823、SW620、HepG2、H460細胞72h的IC50值分別為:10.38μg/ml、10.63μg/ml、13.58μg/ml、13.90μg/ml;AmB-NSP培養(yǎng)上述四種細胞對應的IC50值分別為6.76μg/ml、6.93μg/ml、10.03μg/ml、9.74μg/ml。結(jié)果表明，AmB對BGC-823和SW620細胞的殺傷效果較強，而對HepG2和H460細胞的抑制作用相對適中，抗腫瘤活性具有

15、細胞選擇性;AmB-NSP較AmB-Sol對腫瘤細胞的殺傷作用顯著增強，并具有時間和劑量依賴性。這可能是因為納米結(jié)晶顯著提高了AmB的溶解度和溶出速率，使其在腫瘤細胞表面達到足夠的藥物濃度;再者，納米結(jié)晶促進了AmB對腫瘤細胞膜的粘附性和滲透性，增大了腫瘤細胞對AmB的內(nèi)吞作用，從而提高了抗腫瘤效果。此外，PI染色和Hoechst染色也進一步證實了AmB-NSP能促進腫瘤細胞的凋亡，具有更強的癌細胞毒性。
　　 流式細胞儀周期檢

16、測結(jié)果顯示，AmB能將BGC-823細胞捕獲在G1期，AmB-NSP顯著增大了細胞在G1期的比率。由此推測，AmB-NSP誘導細胞凋亡可能發(fā)生在G1期。凋亡檢測定量地反映了AmB誘導細胞凋亡不同時期的比率，證實了納米結(jié)晶能促進AmB對癌細胞的凋亡作用并具有劑量依賴性，在抗腫瘤治療方面有潛在的應用價值。
　　 本文將難溶性抗癌藥阿霉酮B開發(fā)為納米結(jié)晶在國內(nèi)外是首次報道，為其深入研究和開發(fā)為注射劑應用于臨床提供思路和參考依據(jù)，具有較